Enzimas modificadoras de la pared celular vegetal. Celulasas de interés biotecnológico papelero

Abstract

La pared celular vegetal se compone de celulosa, hemicelulosas y lignina, que están fuertemente entrelazados y unidos por enlaces covalentes y no covalentes. La misma representa la fuente principal de celulosa, que constituye la materia prima para la fabricación de papel y una gran variedad de productos. El principal impedimento tecnológico para la utilización de la celulosa es la ausencia de una tecnología de bajo costo que disminuya la recalcitrancia de la misma. Se han desarrollado diversos métodos fisicoquímicos y biológicos que mejoran la despolimerización de la lignocelulosa. Los objetivos del trabajo se centraron en la identificación y caracterización de enzimas con capacidad de hidrólisis, oxidación o modificación de la celulosa, y su posterior aplicación en el refinado de la pasta de papel y en general en biotecnología de la biomasa.

La primera enzima identificada fue la liquenasa de Paenibacillus barcinonensis BP-23, obtenida por el método del Genome Walking. La secuencia aminoacídica deducida del gen codificante, reveló que es una proteína monodominio perteneciente a la familia 16 de glicosil hidrolasas, fue nombrada: Lic16A, la cual mostró actividad exclusiva sobre β-1,3-1,4-glucanos y estabilidad a 55ºC durante 3h en condiciones moderadas de pH. El análisis mediante cromatografía de capa fina mostró que la enzima liberaba una mezcla compleja de oligosacáridos de diferente longitud y movilidad intermedia entre celooligosacáridos.

Se efectuó la secuenciación del genoma de la cepa Paenibacillus barcinonensis BP-23 por la plataforma Illumina con la técnica HiSeq 2000, se realizó el ensamblaje de novo con el programa SGA. Después del ensamblaje parcial del genoma, se identificaron cuatro xilanasas nuevas, siete arabinofurosidasas putativas y una nueva celulasa, que fue nombrada Cel6D.

La secuencia aminoacídica deducida de cel6D, la nueva celulasa identificada, reveló que es una proteína multidominio de la familia 6 de glicosil hidrolasas con la estructura GH6-Fn3-CBM3. Cel6D presenta todos los residuos cruciales para la actividad catalítica y mostró actividad exclusiva sobre celulosa cristalina, preferentemente sobre PASC, indicando que es un exoglucanasa. Cel6D presenta algunas limitaciones en termoestabilidad, ya que pierde el 80% de actividad en 15 min a 55ºC. El análisis mediante cromatografía de capa fina mostró que la enzima liberaba celobiosa como único producto de hidrólisis. La ingeniería de proteína de Cel6D, reveló que la enzima truncada, Cel6D-GH6, perdía la actividad hidrolítica, mientras que la enzima truncada Cel6D-GH6Fn3 perdió el 89% de actividad. Estos resultados demostraron la importancia de todos los módulos que componen la enzima. Para evaluar la posibilidad de un efecto cooperativo entre celulasas, se estudió el sistema endo-exo entre endoglucanasas (Cel9B, Cel5A de P. barcinonensis) y la exoglucanasa

(Cel6D). Se evidenció sinergismo entre Cel9B y Cel6D sobre sustratos celulósicos insolubles, mientras que no se encontró efecto sinérgico entre Cel5A y Cel6D.

Se identificó una enzima con homología a LPMO’s en la cepa Paenibacillus illinoisensis, aislada de suelos subtropicales de Brasil, que fue nombrada CBP3. A pesar de la alta homología de esta enzima con LPMO’s caracterizadas no se logró obtener resultados positivos de actividad despolimerizante en los ensayos realizados sobre sustratos celulósicos de laboratorio. Sin embargo se obtuvo liberación de azúcares a partir de pastas de papel.

El uso de enzimas modificadoras sin actividad hidrolítica podría facilitar la degradación de la celulosa. Otra enzima estudiada fue la expansina BsEXLX1 de Bacillus subtilis, que al ser aplicada en pastas de lino, causó una modificación en la estructura de las fibras, que presentaron una anchura incrementada.

La aplicación de Cel6D de P. barcinonensis en pastas de lino ECF, potencia su respuesta al refinado. Se consiguió una aceleración de los efectos primarios y secundarios del refinado y una mayor hidratación en la matriz interna de las fibras, que favorecen los mecanismos de cohesión interfibrilar. Como resultado se obtuvo una notable mejora de las propiedades de resistencia mecánica del papel. La simultánea disminución de la densidad que causa la aplicación de la enzima es un hecho diferencial y único de la exoglucanasa Cel6D. El efecto de biorefinado producido permite catalogar a la enzima Cel6D como “coadyuvante del refinado”. Su aplicación permite reducir la energía de refinado para conseguir determinadas propiedades de resistencia.

The aims of the work presented are the identification and characterization of enzymes that can hydrolyse, oxidize or modify cellulose, and their application on pulp refining and on biomass biotechnology.

The first enzyme identified was a lichenase from Paenibacillus barcinonensis BP-23, obtained by the Genome Walking method. The deduced amino acid sequence from the coding gene revealed that is a monodomain protein of family 16 of glycoside hydrolases, which was named as Lic16A. The protein showed exclusive activity on β-1,3-1,4-glucans and stability at 55ºC for 3h under moderate conditions of pH. Analysis by thin-layer chromatography showed that the enzyme released a complex mixture of oligosaccharides of different lengths and intermediate mobility among celloligosaccharides.

Genome sequencing of the strain Paenibacillus barcinonensis BP-23 was determined by the Illumina platform with the HiSeq 2000 technique, and de novo assembly was performed with the program SGA. A number of 559 scaffolds were obtained, and the estimated genome size was 6510186 bp with a GC content of about 45.8%. In the assembly were identified four new xylanases, seven putative arabinofuranosidases and a new cellulase, which was named as Cel6D.

The deduced amino acid sequence from cel6D, revealed that is a multidomain protein of the glycoside hydrolase family 6 with the structure GH6-Fn3-CBM3. Cel6D showed exclusive activity on crystalline cellulose, preferably on PASC, showing it is an exoglucanase. Analysis by thin-layer chromatography showed that the released enzyme cellobiose as the unique hydrolysis product. Protein engineering of Cel6D revealed that the truncated enzyme Cel6D-GH6 lost hydrolytic activity, while the truncated enzyme Cel6D-GH6Fn3 lost 89% of activity. These results showed the importance of all modules of the enzyme. Cel6D showed synergism with endoglucanase Cel9B from P. barcinonensis on depolymerization of insoluble cellulosic substrates.

An enzyme with homology to LPMO's was identified in the strain Paenibacillus illinoisensis C37, isolated from subtropical soils from Brazil, which was named as CBP3. Positive results of activity were not obtained in assays performed on laboratory cellulosic substrates. Nevertheless, the release of sugar was obtained from flax pulps.

Another studied enzyme was the expansin BsEXLX1 of Bacillus subtilis, which when applied to flax pulps, produced a modification in the fibers structure that resulted in an increased width.

Application of Cel6D of P. barcinonensis in ECF flax pulps enhances their response to refining. An acceleration of the primary and secondary refining effects and an increased hydration in the internal matrix of the fibers were achieved, which promote interfibrillar cohesion mechanisms. Application of the enzyme increased mechanical properties of paper. This effect of biorefining

allows to classify the enzyme Cel6D as a ‘refining co-adjuvant’ which reduces energy consumption.