Rac1 y Calmodulina regulan la dinámica de membrana durante la endocitosis independiente de Clatrina

Abstract

El fosfolípido PI(4,5)P2 ha sido descrito ampliamente como un factor clave en la endocitosis. De hecho, numerosas proteínas endocíticas contienen dominios de unión específicos para PI(4,5)P2. La dinámica de su metabolismo está finamente regulada por diversos enzimas que pueden fosforilarlo, defosforilarlo, hidrolizarlo o sintetizarlo a partir de precursores, cambiando su concentración en dominios específicos de la membrana. En los primeros pasos de la endocitosis, la concentración de PI(4,5)P2 aumenta y recluta clatrina u otros tipos de proteínas de cubierta o asociadas a procesos de remodelación de membrana, dando lugar a una invaginación. Más tarde, los niveles de PI(4,5)P2 deben reducirse para completar el proceso de formación de vesículas.

En los últimos años, nuestro grupo ha descrito como la calmodulina (CaM) está regulando la interacción entre Rac1 y PIP5K, el principal enzima productor de PI(4,5)P2. La inhibición de la CaM, que es el sensor de calcio (Ca2+) más importante en células no musculares, induce la formación de invaginaciones tubulares ricas en PI(4,5)P2 provenientes de la membrana plasmática, que parecen formar parte de un proceso endocítico independiente de clatrina. Sin embargo, también se observó que la sobreexpresión del Rac1 constitutivamente activo (Rac1G12V) inhibe las tubulaciones inducidas por la inhibición de CaM, lo que podría deberse a la acción de efectores de Rac1 relacionados con el metabolismo de PI(4,5)P2, como la fosfolipasa C (PLC), o relacionados con la dinámica del citoesqueleto. Durante esta tesis, hemos demostrado el requerimiento de PI(4,5)P2 en la formación de los túbulos endocíticos, y hemos descrito como la CaM puede estar regulando sus niveles a través de la regulación de Rac1 y posiblemente de PKC, específicamente en las balsas lipídicas, donde se producen la mayoría de procesos endocíticos independientes de clatrina.

La dinámica de las adhesiones focales, que vinculan el citoesqueleto con la matriz extracelular a través de la integrina, está también regulada por la endocitosis durante la migración celular. Existe además una estrecha regulación recíproca entre las RhoGTPasas y el tráfico de integrinas, que se extiende a lo largo del eje anteroposterior de la célula en migración, en el que generalmente Rac1 está activado en la parte anterior, y RhoA en la parte posterior. Los análisis de internalización realizados nos han permitido descubrir que las tubulaciones inducidas por PI(4,5)P2 son una vía de entrada de beta1-integrina, que aceleran su internalización y la excluyen de los compartimentos endosomales tempranos, impidiendo posiblemente un reciclaje rápido hacia la membrana plasmática. La activación constitutiva de Rac1 impide esta entrada rápida a través de los túbulos.

Los sitios de endocitosis están estrechamente ligados al citoesqueleto de actina, ya que éste puede contribuir a la deformación, invaginación o rotura de la membrana. La cortactina modula la dinámica del citoesqueleto de actina durante la CDE y la CIE, en asociación con diversas proteínas como WASP, dinamina o Arp2/3. Se sabe que la cortactina requiere de Rac1 para ser translocada a la membrana plasmática pero no se conoce bien el mecanismo. Asimismo, la tensión de la membrana plasmática es también un elemento clave en la regulación de la internalización, estimulándose la endocitosis en regiones con una baja tensión de membrana. La miosina, en especial la miosina II de células no musculares, es, junto con la actina, uno de los principales reguladores de la tensión de membrana, especialmente durante la migración celular. El estudio de la función de cortactina y miosina permitió demostrar que la actividad de Rac1 regula negativamente la formación de las invaginaciones tubulares inducidas por PI(4,5)P2. Hemos demostrado que la acción de POR1, un efector conocido de Rac1, media la translocación de cortactina a la membrana plasmática. Además, se ha descrito por vez primera una activación

directa de ROCK1 por parte de Rac1, que pemite la activación de la miosina y su asociación con el citoesqueleto de actina, lo cual es necesario para la inhibición de las tubulaciones por Rac1 activo.

It has been described that specific calmodulin inhibition, W13-treatment, increased the percentage of cells with tubular plasma membrane structures, which corresponds to the Arf6-dependent and clathrin-independent endocytosis pathway. The present thesis shows that these tubular transport membranes by which β1-integrin is endocytosed, depends on the increased PI(4,5)P2 levels in lipid rafts, dynamin and dynein motor proteins. As for W13, exogenous PI(4,5)P2 or PIP5K expression generated-tubules are inhibited by expression of the active Rac1 mutant (Rac1-G12V). Therefore, the molecular mechanisms downstream of Rac1 that controls such tubules formation have been analyzed biochemically and by the expression of different Rac1 mutants. The results indicate that PLC and ROCK1, possibly in combination with POR1, are the main Rac1 effectors to impede plasma membrane invagination, by decreasing the PI(4,5)P2 levels and promoting cortical actomyosin, respectively. Importantly, among the interplay of proteins that participates in membrane remodeling, this study reveals for the first time that the well-known downstream RhoA effector ROCK1 acts as an important effector of Rac1 to regulate actin-myosin at the cell cortex. This study provides new insights in the mode of Rac1 action on plasma membrane dynamics regulation.