Optimización y estandarización de un protocolo para el estudio de perfiles peptídicos séricos mediante la tecnología Maldi-Tof MS. Aplicación en la búsqueda de nuevos biomarcadores de diagnóstico precoz

Abstract

El estudio de perfiles peptídicos mediante la tecnología de espectrometría de masas MALDI-TOF es una metodología útil y prometedora para la búsqueda de nuevos biomarcadores de diagnóstico. Sin embargo, existen muchos factores que pueden influir en la variabilidad de los resultados obtenidos. Un análisis previo de dichos factores, así como el diseño de un protocolo estandarizado que sea óptimo para la búsqueda de los biomarcadores que se buscan, es fundamental si no se quiere fracasar en el estudio de investigación.

En el presente trabajo se ha diseñado un protocolo estandarizado y optimizado para el estudio de perfiles peptídicos séricos que incluye las fases preanalítica, analítica y postanalítica, con el objetivo de poder ser aplicado a diferentes patologías en la búsqueda de nuevos biomarcadores de diagnóstico precoz.

La fase preanalítica se automatizó mediante el uso de un robot, siguiendo el protocolo previamente optimizado de forma manual. Tras la automatización, se evaluó su efecto en la reproducibilidad de los resultados a partir del cálculo del CV interdía del área media de cada uno de los picos presentes en el espectro. El CV interdía pasó de ser un 62%, cuando el proceso se realizaba de forma manual, a un 11.6% cuando se automatizó el proceso.

En el presente trabajo también se ha analizado la influencia del género y la edad sobre los perfiles peptídicos séricos llegando a la conclusión de que el efecto de estas dos variables es mínimo y se puede considerar despreciable.

Para el análisis estadístico de los resultados, se diseñó un modelo estadístico capaz de buscar la combinación que, con menor número de péptidos, consiguiera discriminar entre los grupos de estudio con una mayor sensibilidad y especificidad diagnóstica.

El protocolo estandarizado y optimizado se aplicó a la búsqueda de nuevos biomarcadores de diagnóstico precoz de cáncer de páncreas. Tras el estudio se obtuvo un panel de biomarcadores que mejoraba la capacidad diagnóstica del marcador clásico CA 19.9 añadiendo los péptidos seleccionados en el estudio (1006,52 Da y 1929,65 Da). Con este panel, se mejora notablemente la sensibilidad diagnóstica de un 75,5% (CA 19.9) a un 89,8% (panel) y la especificidad diagnóstica de un 87,3% (CA 19.9) a un 92,7% (panel). Dichos resultados quedan pendientes de validación e identificación de los péptidos seleccionados. En el estudio de cáncer de páncreas también se concluye que el péptido 4155 Da es característico de enfermedad pancreática. Dicho péptido queda pendiente de validación e identificación.

El protocolo estandarizado y optimizado también se aplicó en un estudio de búsqueda de biomarcadores de diagnóstico precoz de ictus isquémico. En este estudio se concluye que el péptido 2155 Da es un buen biomarcador de diagnóstico precoz con un sensibilidad diagnóstica del 88,6% y una especificidad diagnóstica del 96,9% para discriminar entre ictus isquémico y controles sanos. Además, el péptido 2155 Da puede discriminar entre ictus isquémico y enfermedad neurológica aguda al presentar diferente patrón de expresión a lo largo del tiempo en ambas patologías. Queda pendiente la validación de este resultado así como la identificación del péptido.

Tras los resultados obtenidos, se puede concluir que el protocolo optimizado y estandarizado propuesto en el presente trabajo de tesis, es útil y se puede aplicar a distintos tipos de patología con el objetivo de encontrar biomarcadores séricos de diagnóstico precoz.

The study of peptide profiling by MALDI-TOF MS is a powerful technology in the research of new biomarkers of diagnosis. Nevertheless, there are many factors that can influence in the variability of the results. The aim of this thesis was to design an optimized and standardized protocol for the study of serum peptidome profiling in the research of diagnostic biomarkers.

The preanalytical phase was automated by a robot. The automation improved the reproducibility of the results from a 62 % (manual) to an 11.6 % (robot) of coefficient of variation interassay.

In the study was analyzed the influence of gender and age in the serum peptidome profiling concluding that the effect of both of them was minimum.

In order to analyze the results we designed a new statistical model based in the binary logistic regression. This model tries to search the combination that, with the minimum number of peptides, can distinguish between the groups of the study with the best sensitivity and specificity.

The new protocol was applied in two studies. The first study was about the search of new early diagnostic biomarkers in pancreatic cancer. In this study we found a panel of three biomarkers (1006.52 Da, 1929.65 Da and CA 19.9) that improved the sensitivity and the specificity of the CA 19.9 when this biomarker was used alone. Furthermore, we concluded that the peptide 4155 Da is a specific biomarker of pancreatic cancer. The second study was about the search of new early diagnostic biomarkers in ischemic stroke. We concluded that the peptide 2155 Da is a good biomarker to distinguish between ischemic stroke and healthy volunteers. Moreover, the expression of this peptide with time, is different between the group ischemic stroke and the group acute neurological diseases. All these results must be validated with a second study.