Paper de les cèl·lules progenitores hepàtiques en l’hepatitis alcohólica i la regeneració hepàtica

Abstract

La malaltia hepàtica per consum d'alcohol és una hepatopatia crònica amb alta taxa de mortalitat. Aquests pacients poden presentar episodis d'hepatitis alcohòlica (HA), caracteritzats histològicament per dany hepatocel·lular, colèstasi, esteatosi, fibrosi i infiltrat important de cèl·lules inflamatòries, principalment neutròfils. Actualment, els tractaments existents no són efectius en tots els pacients, sent necessari explorar teràpies alternatives.

El fetge posseeix una capacitat de regeneració única. Després d'un dany hepàtic crònic, la capacitat replicativa dels hepatòcits queda compromesa i dels canals de Hering emergeixen i proliferen les cèl·lules progenitores hepàtiques (CPH). Aquestes cèl·lules, en quiescència en un fetge sa, s'activarien després d'un dany, donant lloc a la reacció ductular (RD), la proliferació de les branques terminals de l'arbre biliar. No obstant, el seu grau de contribució a generar nous hepàtocits in vivo és desconegut. Recentment, mitjançant tècniques de seguiment de llinatge cel·lular s'ha avaluat la participació de les CPH en la regeneració hepàtica, amb resultats contradictoris.

L'objectiu d'aquesta tesi és estudiar la presència i paper de les CPH en l'HA i analitzar el seu grau de contribució a la regeneració hepàtica en situació fisiològica i després d'un dany hepàtic. A part, hem avaluat el perfil d'expressió gènica de les CPH i l'efecte que té aquest perfil en el reclutament de neutròfils. En primer lloc, hem observat com marcadors de CPH (EpCAM, KRT7 i PROM1) estan sobreexpressats en fetges de pacients amb HA comparats amb fetges sans i de pacients amb altres etiologies. A més, PROM1 i KRT7 són bons marcadors prognòstics per a predir la mortalitat a curt termini en pacients amb HA. Finalment, hem confirmat per immunohistoquímica en aquests pacients la presència de CPH i d'una important RD formada per cèl·lules KRT7 i EpCAM positives, així com d'hepatòcits que expressen EpCAM, suggerint els seu origen en les CPH.

La generació de nous hepatòcits per part de les CPH s'ha avaluat mitjançant un ratolí transgènic que permet fer un seguiment de llinatge de cèl·lules de l'epiteli biliar HNF1β positives i la seva progènie. En situació fisiològica, hem observat per immunohistoquímica com la contribució de cèl·lules HNF1β positives a la generació d'hepatòcits és nul·la, al no observar-se hepatòcits expressant el producte del gen reporter β-GAL. En canvi, només en situacions específiques de dany hepàtic crònic (model per dieta CDE) s'observa una població d'hepatòcits doble positius pel marcador d'hepatòcits HNF4α i el gen reporter YFP, demostrant que una població d'hepatòcits té origen en cèl·lules HNF1β positives. No obstant, aquesta contribució és mínima.

Finalment, a partir d'RNA aïllat de cèl·lules HNF1β positives de dos models animals on s'indueixen les CPH (dietes CDE i DDC), s'ha realitzat un microarray que ha permès analitzar el perfil d'expressió gènic de les CPH i determinar gens i vies de senyalització diferencialment expressats entre aquests models. Aquest anàlisi ha determinat que les CPH posseeixen un perfil inflamatori en el model DDC, on no contribueixen a la generació d'hepatòcits al sobreexpressar quimiocines proinflamatòries involucrades en el reclutament de neutròfils, suggerint que les CPH participarien en el seu reclutament durant un dany hepatìc crònic. Aquest perfil inflamatori és també present en cèl·lules de la RD aïllades de pacients amb HA.

En aquesta tesi s'ha conclòs que l'HA es caracteritza per la presència de CPH i d'una important RD. Una major expressió de marcadors de CPH s'associa a major severitat del dany hepàtic i a major mortalitat a curt termini en pacients amb HA. En ratolins, les cèl·lules de l'epiteli biliar no contribueixen a generar nous hepatòcits. Només després d'un dany hepàtic específic, tot i tenir potencial per a generar nous hepatòcits, les CPH contribueixen mínimament, establint els hepatòcits preexistents com a principals responsables de la regeneració hepàtica.

Alcoholic liver disease (ALD) is a main cause of chronic liver disease with high mortality. Some ALD patients develop episodes of alcoholic hepatitis (AH), an acute event in a chronic episode of ALD, histologically characterized by the presence of fibrosis, hepatocellular damage and inflammatory response, mainly neutrophils.

After persistent liver damage, hepatocyte proliferation is compromised, and liver progenitor cells (LPC), located in the canals of Hering and in quiescence in healthy liver, are activated and start to proliferate, giving rise to what is known as ductular reaction (DR). However, the extent of LPC contribution to liver recovery and hepatocyte generation after injury remains controversial.

In this doctoral thesis we have increased the current knowledge regarding the role of LPC in liver regeneration using a translational approach. First, we observed that an increased expression of LPC markers (KRT7, PROM1, EpCAM) correlates positively with severity of liver disease and short-term mortality in patients with HA. In addition, we identified by immunohistochemistry in these patients an increase of LPC population and an important DR, as well as EpCAM-positive hepatocytes, suggesting a population of hepatocytes with LPC origin.

Furthermore, using a transgenic HNF1bCreERROSA26RLacZ/YFP mice that allowed us to trace the fate of LPC and their progeny, we shed light on LPC contribution to liver regeneration. In homeostasis and in most liver injury models, LPC are capable to generate biliary cells but do not participate in hepatocyte generation. Only in certain injury conditions (CDE diet) HNF1β cells contribute to newly-generated hepatocytes population, but minimally, supporting the hypothesis that existent hepatocytes are the main source of new hepatocytes.

We also performed a microarray of isolated LPC from two models with remarkable DR and LPC expansion, with (CDE diet) or without (DDC diet) contribution to hepatocytes. Transcriptomic analysis showed differences in LPC gene expression in both models, suggesting that the type of damage determines LPC gene expression profile and their contribution to hepatic regeneration. An inflammatory LPC profile, expressing chemokines involved in neutrophil recruitment, is associated with poor contribution to regeneration. These results suggest that neutrophil recruitment during injury is triggered by LPC chemokine production. This profile resembles to LPC profile obtained after isolating by laser-capture microdissection KRT7-positive DR cells from HA patients. After sequencing their RNA, we also identified in HA new genes and signalling pathways that could play an important role in LPC activation and DR activation.

The data presented in this thesis provide new information regarding LPC presence an DR expansion in HA. Besides, we shed light on the role of LPC and their contribution to liver regeneration in mice. Finally, we identified new genes involved in LPC activation that will help to better understand their role in liver regeneration.