Investigation on force detection methods for optical trapping and sensing inside living cells

Abstract

Optical Tweezers (OT) are a light-based non-invasive tool that has played an important role during the last decades in the field of biophotonics, together with the advances in optical microscopy techniques. Optical trapping and micromanipulation of microscopic objects is nowadays possible with tightly focused laser beams, with the capability of measuring forces acting on the trapped particle in the order of piconewtons. OT have found numerous applications in the field of biophysics, and more specifically in molecular motor studies. One of the open challenges in the field is measuring molecular motor forces in their natural (in vivo) environment: the interior of living cells. Due to the complex mechanical properties of the cell cytoplasm, standard trap force calibration methods do not apply in this environment.

In this thesis we investigate two recent optical force calibration methods: active-passive calibration in viscoelastic media, and direct force measurements via light momentum changes. The two methods are tested and cross-validated inside living cells, and an application involving intracellular molecular motor stall force measurements is demonstrated. The obtained results prove the possibility of measuring forces inside the cell cytoplasm with holographic tweezers, even with an object-independent trap force calibration when the conditions for the momentum-based technique are fulfilled.

We also present an algorithm for manipulating groups of optical traps with minimal computational cost, using random mask multiplexing combined with iterative computer-generated holograms for dynamic holographic optical tweezers.

Les pinces òptiques són una tècnica no invasiva, basada en llum, que ha tingut un paper important en les últimes dècades en el camp de la biofotònica, en combinació amb les noves tècniques de microscòpia. L’atrapament i manipulació d’objectes microscòpics per mitjans òptics és avui en dia una possibilitat real, que permet no només desplaçar objectes, sinó també mesurar les forces que actuen sobre aquests. És per això que les trampes òptiques han trobat nombroses aplicacions en el camp de la biofísica, i més concretament, en l’estudi de motors moleculars. Un dels reptes pendents en aquest sentit és la mesura de força de motors moleculars en el seu entorn natural: l’interior de cèl·lules vives. Degut a la complexitat mecànica del citoplasma, els mètodes estàndard de calibratge de pinces òptiques no són vàlids en aquest entorn.

En aquesta tesi s’investiguen dos mètodes recents de mesura de força que tenen el potencial de ser utilitzats a l’interior cel·lular: la calibració activa-passiva de pinces òptiques en medis viscoelàstics, i la mesura força directa a través de canvis en el moment del feix de llum. Es demostra que els dos mètodes, basats en principis teòrics totalment diferents, donen resultats compatibles dins de cèl·lules, validant així la possibilitat de mesurar forces pinces òptiques a l’interior cel·lular de forma fiable. La utilitat pràctica del mètode de força directa, la constant de calibració del qual és independent de l’objecte atrapat, es demostra amb una aplicació concreta: la mesura de força de motors moleculars involucrats en el transport de vesícules en cèl·lules animals.

També presentem un algoritme per a la manipulació dinàmica de grups de trampes òptiques utilitzant holografia digital, amb un cost computacional mínim. S’utilitza el multiplexat espacial de màscares aleatòries, partint d’hologrames pre-generats amb mètodes iteratius, per experiments de manipulació a temps real.