ARNs no codificants petits en Limfoma de Hodgkin: regulació epigenètica de micro RNAs i importància de la via PIWI/piRNA

Abstract

El limfoma de Hodgkin (LH) és una neoplàsia de cèl·lules B que es caracteritza per tenir un 1% de cèl·lules tumorals, anomenades cèl·lules de Hodgkin i Reed-Sternberg (HRS), envoltades per un microambient reactiu. Per això, l’estudi de la funció i del paper pronòstic dels ARNs no codificants petits en gangli sencer, i no únicament en les cèl·lules tumorals, pren un gran significat.

Els miRNAs participen en els processos fisiològics però també intervenen en el desenvolupament de malalties, incloent el càncer. Poden actuar d’oncogens o de gens supressors de tumors depenent del seu ARN missatger diana. La identificació dels miRNAs inhibits durant el procés de limfomagènesi per metilació ens permetrà identificar miRNAs amb funció de supressors tumorals en el LH clàssic. Després de tractar amb un agent desmetilant, el 5-Aza-dC, dues línies cel·lulars de LH, aquestes reexpressaven diversos miRNAs, dels quals 10 dels quals eren comuns i tenien una illa CpG com a màxim a una kilobase del lloc d'inici de la transcripció. Mitjançant una PCR específica de metilació (MSP), vam observar que, entre d’altres, el miR-34a i el miR-203, coneguts supressors tumorals en altres neoplàsies, estaven metilats en quatre línies cel·lulars de LH. A continuació, mitjançant MSP in situ vam avaluar l’estat de metilació d’aquests dos microRNAs en mostres de teixit de pacients. Vam observar que el miR-34a i el miR-203 mostraven marcatge ens els nuclis de les cèl·lules HRS quan utilitzàvem el primer que detectava les seqüències metilades i cap senyal utilitzant el primer per a les seqüències desmetilades. Per últim vam avaluar els efectes del 5-Aza-dC in vitro després de tractar les cèl·lules amb dosis creixents de fàrmac, el qual tenia un efecte citotòxic a dosis elevades però el màxim efecte de reexpressió dels miRNAs miR-34a i miR-203 es trobava a dosis baixes i intermèdies.

La via PIWI/piRNA es creia que només estava activa en cèl·lules germinals i embrionàries però actualment hi ha evidències que també pot jugar un paper clau en el procés de carcinogènesi, ja que la seva desregulació provoca inestabilitat genòmica entre d’altres funcions. A més, recentment s’ha identificat el valor pronòstic dels nivells d’expressió de les proteïnes PIWI, principals reguladores del procés de biogènesi dels piRNAs. Creiem que aquesta via pot trobar-se desregulada en el LH clàssic i jugar un paper clau en el procés de limfomagènesi. Es detecten nivells baixos de PIWIL1 en les línies cel·lulars de LHc, però no en les cèl·lules B controls. En les mostres de pacients, detectem PIWIL1 en el citoplasma de les cèl·lules HRS en un terç dels pacients analitzats. PIWIL2 i PIWIL4 es troben infraexpressats en les línies de LH en comparació amb les cèl·lules B. En totes les mostres analitzades de pacients detectem PIWIL2 i PIWIL4. Els 3 piRNAs seleccionats (piR-651, piR-20365 i piR-20582) s’expressen en totes les mostres analitzades i estan significativament sobreexpressats en LHc en comparació als GRs. De forma interessant, els pacients amb nivells baixos de piR-651 presenten una menor taxa de resposta complerta (p=0.002) i una pitjor supervivència global (p=0.02). L’anàlisi de piR-651 en mostres de sèrum mostra que es troba infraexpressat al diagnòstic (p=0.01) però recupera els nivells normals a l’assolir la resposta complerta (p=0.05). Mitjançant hibridació in situ podem veure que el piR-651 s’expressa de forma elevada en el citoplasma de les cèl·lules HRS.

Classical Hodgkin lymphoma (cHL) is a B cell neoplasia that comprises 11% of all lymphomas and is characterized by the presence of few tumoral cells, the so called Hodgkin Reed-Sternberg (HRS) cells, surrounded by a reactive microenvironment. Studying the functions and the prognostic role of small non-coding RNAs in the whole lymph node and not only in the tumoral cells is of great importance.

Epigenetic mechanisms are crucial for the inactivation of key genes related to the survival of HL cells, and methylation is a frequent epigenetic mechanism of microRNA silencing. We have examined the methylation-induced silencing of tumor suppressor microRNAs in HL cell lines and confirmed our results in patient lymph nodes. In addition, we evaluated the in vitro effectiveness of 5-aza-2-deoxycytidine (5-Aza-dC) in HL cell lines. Ten microRNAs containing CpG islands in their promoter region were re-expressed in both the L-428 and L-1236 cell lines. Interestingly, miR-34a and miR-203, both known tumor suppressor microRNAs, were found to be methylated in cell lines and in patient samples. 5-Aza-dC treatment resulted in a dose-dependent antiproliferative effect at 72 h in all the HL cell lines. In summary, 5-Aza-dC treatment of HL cell lines inhibits proliferation at high doses and produces re-expression of the tumor suppressor microRNAs at low-intermediate doses.

PiwiRNAs, small non-coding RNAs processed by Piwi proteins, are involved in maintaining genome stability in germline cells. Recently, piwiRNA expression has been identified in some tumors. We have examined the potential reactivation of the Piwi/piwiRNA pathway in cHL. We found that Piwi proteins and three selected piwiRNAs, including piR-651, were expressed in cHL patients and cell lines, indicating that the Piwi/piwiRNA pathway is active in cHL. Interestingly, low levels of piR-651 were associated with lack of complete response to first-line treatment, as well as shorter disease-free and overall survival in a cohort of 94 cHL patients. At diagnosis, piR-651 was underexpressed in cHL serum samples compared to healthy controls, while after complete remission, piR-651 levels increased to levels similar to healthy controls. This is the first evidence that piwiRNAs are active in tumor and serum samples and impact prognosis in cHL.