La proteína DOR/TP53INP2 modula negativamente la mitofagia dependiente de Parkin

Abstract

TP53INP2 es una proteína nuclear que activa la autofagia en moscas y células eucariotas. El propósito de esta tesis doctoral fue investigar si TP53INP2 modula la autofagia mitocondrial dependiente de Parkin. Aquí, se demuestra que en un modelo de sobreexpresión de TP53INP2 se reduce la actividad mitofágica en respuesta al agente despolarizante CCCP o a los inhibidores de la cadena respiratoria Oligomicina/Antimicina A, en células que expresan Parkin. Además, este modelo causa modificaciones en el metabolismo mitocondrial. Así por ejemplo, la sobreexpresión de TP53INP2 produjo un incremento de la masa mitocondrial y una mayor susceptibilidad frente al estrés oxidativo mientras que la pérdida de función de TP53INP2 causó una reducción de la masa mitocondrial y del potencial de membrana mitocondrial. Asimismo, se pudo determinar que no hay cambios en la expresión de reguladores de la biogénesis mitocondrial (PGC-1α), esto sin duda refuerza la hipótesis de que el efecto de TP53INP2 sobre el metabolismo mitocondrial es debido a cambios en la mitofagia. Posteriormente, con el propósito de analizar los mecanismos por los cuales TP53INP2 disminuye la mitofagia dependiente de Parkin, se analizó la localización celular de la proteína. Sorprendentemente, se observó que ciertos estresores mitocondriales causan el reclutamiento de TP53INP2 a la mitocondria y este efecto es acelerado por Parkin. Prosiguiendo estos resultados en células que expresan Parkin, se descubrió que TP53INP2 inhibe la acumulación de PINK1 en condiciones en las cuales la membrana mitocondrial se encuentra despolarizada. Al mismo tiempo, se encontró una reducción en la estimulación de la fosforilación de la ubiquitina en el residuo S65. Por otra parte, se determinó que TP53INP2 colocaliza con Parkin en el núcleo en condiciones basales o en condiciones de daño mitocondrial. Esta aparente interacción no requiere PINK1 dado que células deficientes en esta proteína también mostraron una colocalización positiva en ambas situaciones. De igual forma, TP53INP2 interactúa físicamente con Parkin, esta interacción es mantenida con una forma corta de Parkin que carece del dominio UBL, la cual a diferencia de la forma larga no colocaliza con la mitocondria en condiciones de despolarización de la membrana mitocondrial. Sin embargo, la interacción fue abolida por una forma mutante de Parkin que carece de la actividad ubiquitina ligasa.

En suma, en esta tesis se demuestra que TP53INP2 participa en el mantenimiento de la función e integridad mitocondrial a través de un mecanismo que implica la inhibición de PINK1 en la mitocondria dañada y por consiguiente la disminución de la mitofagia a través de la vía PINK1/Parkin.

Los resultados de esta tesis indican que TP53INP2 representa una especie de interruptor que activa la autofagia general o no selectiva pero previene un tipo de autofagia selectiva, la mitofagia dependiente de PINK1/Parkin, en células de mamífero.

TP53INP2/DOR is a nuclear protein that shuttles to the cytosol and stimulates autophagosomal formation and autophagy activity in mammalian cells and in flies. In this study we explored whether TP53INP2 also modulates mitochondrial autophagy. To this end, we analyzed the effects of TP53INP2 on Parkin-dependent mitophagy. TP53INP2 gain-of-function markedly reduced mitophagic activity in response to different stresses in Parkin-expressing cells. In keeping with these observations, genetic manipulation of TP53INP2 caused modifications of mitochondrial metabolism. Thus, TP53INP2 gain-of-function caused enhanced mitochondrial mass and high susceptibility to oxidative stress whereas TP53INP2 loss-of-function reduced mitochondrial mass and mitochondrial membrane potential. Again, in support of an effect of TP53INP2 mediated by changes in mitophagy, TP53INP2-dependent changes in mitochondrial metabolism were not a consequence of alterations in regulators of mitochondrial biogenesis (PGC-1α). In order to analyze the mechanisms by which TP53INP2 attenuates Parkin-dependent mitophagy, we analyzed the cellular localization of the protein. Surprisingly, mitochondrial stressors caused the recruitment of TP53INP2 to the mitochondria and this was accelerated by Parkin. In keeping with the mitochondrial localization of the protein, TP53INP2 inhibited PINK1 accumulation following mitochondrial depolarization, and in parallel it reduced the stimulation of ubiquitin Ser65 phosphorylation, and protein ubiquitination upon mitochondrial damage in Parkin-expressing cells. TP53INP2 showed a surprising property that is to colocalize with Parkin in the nucleus under basal conditions or in mitochondria upon mitochondrial damage. The colocalization of Parkin and TP53INP2 does not require PINK1 (PINK1-deficient cells also show the colocalization under basal or upon mitochondrial damage). Furthermore, TP53INP2 physically interacts with Parkin. This interaction is maintained under conditions in which mitochondrial clustering does not form by mutant forms of Parkin lacking the UBL domain. Furthermore, the interaction was prevented by Parkin mutant forms lacking ubiquitin ligase activity. In all, we document that TP53INP2 participates in the maintenance of mitochondrial integrity and function through a mechanism that entails the inhibition of PINK1 in damaged mitochondria, and in consequence the attenuation of the PINK1/Parkin pathway of mitophagy. Thus, TP53INP2 represents a switch that activates general macroautophagy but prevents PINK1/Parkin-dependent mitophagy in mammalian cells.