Modulación de la barrera epitelial intestinal por vesículas de membrana y factores solubles secretados por cepas probióticas y comensales de Escherichia coli

Abstract

El epitelio gastrointestinal forma una barrera física y bioquímica que mantiene la segregación entre el huésped y la microbiota intestinal. La integridad de esta barrera es crítica en el mantenimiento de la homeostasis intestinal y su disfunción está relacionada con una gran variedad de enfermedades. La microbiota intestinal, y en particular las bacterias probióticas, modulan la integridad de la barrera reduciendo la permeabilidad intestinal y reforzando las uniones estrechas (TJ) entre las células adyacentes del epitelio intestinal. El probiótico Escherichia coli Nissle 1917 (EcN) es un buen colonizador del intestino humano con probada eficacia terapéutica en la remisión de la colitis ulcerosa en humanos. EcN modula positivamente la barrera epitelial intestinal a través de la regulación positiva y redistribución de las proteínas TJ ZO-1, ZO-2 y claudina-14. La regulación positiva de claudina-14 se ha atribuido a la proteína secretada TcpC. Todavía se desconoce si la regulación de ZO-1 y ZO-2 está mediada por factores secretados por EcN. El objetivo de este estudio fue explorar si las vesículas de membrana externa (OMVs) liberadas por EcN fortalecen la barrera epitelial. Este estudio incluye otras cepas de E. coli de origen intestinal humano portadoras del gen tcpC, tales como ECOR63. Los sobrenadantes de cultivos de las cepas tipo salvaje y de los mutantes tcpC derivados se fraccionaron en OMVs y factores secretados. El impacto de estas fracciones extracelulares sobre la barrera epitelial se evaluó midiendo la resistencia transepitelial, la expresión y la redistribución de varias proteínas de TJ en monocapas de células T-84 y Caco-2. Nuestros resultados muestran que la actividad de refuerzo de la barrera por parte de EcN y ECOR63 no depende exclusivamente de TcpC. Tanto las OMVs como factores secretados por ambas cepas promueven la regulación positiva de ZO-1 y claudina-14, y la regulación negativa de claudina-2. Los efectos mediados por OMVs son independientes de TcpC. La proteína TcpC secretada en forma soluble contribuye a la regulación positiva de ZO-1 y claudina-14, pero no tiene ningún efecto sobre claudina-2. Las fracciones secretadas de ambas cepas, también mostraron actividad protectora de la barrera epitelial en un modelo de barrera dañada por infección con E. coli enteropatógena (EPEC). Este patógeno altera la integridad de la barrera epitelial, causando la regulación negativa de ZO-1, ZO-2, ocludina, y claudina-14, y un reordenamiento alterado de ZO-1 a nivel subcelular. Sin embargo, la infección con EPEC en presencia de las OMVs o de los factores solubles secretados por EcN o ECOR63 evitaron la disminución de la expresión de ocludina y claudina-14. A nivel de redistribución subcelular, ambas fracciones de EcN y ECOR63 suprimieron claramente el efecto de EPEC sobre ZO-1, manteniendo su localización asociada a ocludina en la zona de las TJ.

The gastrointestinal epithelial layer forms a physical and biochemical barrier that maintains the segregation between host and intestinal microbiota. The integrity of this barrier is critical in maintaining homeostasis in the body and its dysfunction is linked to a variety of illnesses. Gut microbes, and probiotic bacteria, modulate the barrier integrity by reducing gut permeability and reinforcing tight junctions (TJ). Probiotic Escherichia coli Nissle 1917 (EcN) is a good colonizer of the human gut with proven therapeutic efficacy in the remission of ulcerative colitis in humans. EcN positively modulates the intestinal epithelial barrier through upregulation and redistribution of the TJ proteins ZO-1, ZO-2 and claudin-14. Upregulation of claudin-14 has been attributed to the secreted protein TcpC. Whether regulation of ZO-1 and ZO-2 is mediated by EcN remains unknown. The aim of this study was to explore whether outer membrane vesicles (OMVs) released by EcN strengthen the epithelial barrier. This study includes other E. coli strains of human intestinal origin that contain the tcpC gene, such as ECOR63. Cell-free supernatants collected from the wild-type strains and from the derived tcpC mutants were fractionated into isolated OMVs and soluble secreted factors. The impact of these extracellular fractions on the epithelial barrier was evaluated by measuring transepithelial resistance (TER) and expression of tight junction proteins in T-84 and Caco-2 polarized monolayers. Our results show that the strengthening activity of EcN and ECOR63 does not exclusively depend on TcpC. Both OMVs and soluble factors secreted by these strains promote upregulation of ZO-1 and claudin-14, and down-regulation of claudin-2. The OMVs-mediated effects are TcpC-independent. Soluble secreted TcpC contributes to the upregulation of ZO-1 and claudin-14, but this protein has no effect on the transcriptional regulation of claudin-2. Thus, inaddition to OMVs and TcpC, other active factors released by these microbiota strains contribute to there inforcement of the epithelial barrier. Also, we analyze the ability of OMVs and soluble factors to protect EPEC-induced TJ damage. TER and distribution of TJ proteins were monitored in polarized cells infected with EPEC in the absence or presence of both extracellular fractions from EcN and ECOR63. EPEC caused 50% reduction in the TER levels and altered localization of ZO-1, ZO-2 and occludin. However, OMVs and soluble factors secreted avoided TER reduction and promoted redistribution of the altered TJ proteins. Our results indicate the ability of OMVs and factors secreted by EcN and ECOR63 to protect TJ disruption caused by EPEC.