Evaluación de la actividad anti-inflamatoria mediante modelos experimentales basados en el embrión de pez cebra. Aplicación a compuestos presentes en la Alimentación

Abstract

Durante las últimas dos décadas se han realizado estudios que sugieren que la inflamación crónica, asociada a una situación de continuo estrés oxidativo, puede ser un factor etiológico en muy diversas patologías como el cáncer, diabetes, enfermedades cardiovasculares, neurológicas y pulmonares. El pez cebra es un modelo ampliamente utilizado en diversos ámbitos de la biología experimental, incluyendo el estudio de mecanismos de patologías humanas y los mecanismos de las repuestas inmunitarias. El pez cebra presenta similitudes genéticas con humanos de un 70 a 80%. Al mismo tiempo, las respuestas oxidativas e inflamatorias pueden ser fácilmente inducibles, reproducibles y visualizadas en sus primeras etapas de desarrollo. Los ensayos realizados mediante embriones o larvas son ensayos in vivo, pero con muchas de las ventajas de los métodos in vitro. El principal objetivo de este proyecto ha sido evaluar la capacidad de modelos experimentales basados en el pez cebra para el screening de substancias naturales presentes en la dieta con actividad anti-inflamatoria y anti-oxidante. Concretamente, en este estudio, se han optimizado y aplicado dos modelos experimentales mediante embriones y larvas de pez cebra. En el primero se evalúa la actividad inhibitoria sobre la migración de neutrófilos en larvas. En el segundo se observa el efecto protector sobre el estrés oxidativo inducido por exposición a un agente oxidante en embriones. Se ha evaluado varios carotenoides, incluyendo el beta-caroteno, licopeno y astaxantina, compuestos fenólicos como naringenina, cianidina, curcumina, entre otros, así como un extracto de sofrito de tomate, uno de los principales ingredientes de la dieta mediterránea. En el primer modelo, hemos optimizado los parámetros experimentales, usando larvas de pez cebra de 4 días post fertilización despigmentadas. Nuestros resultados mostraron que la mayoría de compuestos utilizados, incluido el sofrito de tomate disminuyen la migración de neutrófilos significativamente respecto del control. Los compuestos que presentaron mayor disminución de la migración fueron: ácido clorogénico (66.7%), cianidina (62.5%) respectivamente, mientras que los fármacos anti-inflamatorios (indometacina, piroxicam) y compuestos inhibidores de enzimas NADPH oxidasas

(dibenzoidolium, apocinina) presentan porcentajes de reducción de la migración superiores al 70%. Por el contrario, no se observó ningún efecto al utilizar la amantadina conocido fármaco no anti-inflamatorio. Y en el caso del extracto de sofrito de tomate se reporta una disminución del 40% en la migración. El segundo modelo fue previamente desarrollado en nuestro laboratorio por Boix, (2015). Hemos determinado el efecto protector sobre el estrés oxidativo con los mismos compuestos, en embriones de pez cebra de 0 – 48 horas post fertilización. Hemos observado que la mayoría de compuestos probados, presentan un efecto protector en la letalidad, provocada por el inductor del estrés oxidativo tert-butil hidroperóxido (tBOOH). Además, se observó un efecto protector frente a las anormalidades morfológicas en los de casos de rutina, apigenina y curcumina. Cabe mencionar que se realizaron estudios complementarios de permeabilidad de carotenoides en larvas de pez cebra mediante HPLC-DAD UV, así como análisis de expresión génica de citoquinas pro-inflamatorias (IL-1β, IL-6 y TNF-α) por real-time PCR. En el primer caso se comprobó que existe permeabilidad de carotenoides en larvas de pez cebra. Mientras que en el segundo caso no se observaron diferencias significativas entre los grupos tratados y los controles.

During the last two decades, studies have been carried out suggesting that chronic inflammation, associated with a situation of continuous oxidative stress, can be an etiologic a l factor in many different pathologies such as cancer, diabetes, cardiovascular, neurological and pulmonary diseases. The zebrafish is a model widely used in various fields of experimental biology, including the study of mechanisms of human pathologies and mechanisms of immune responses. The zebrafish presents genetic similarities with humans of 70 to 80%. At the same time, oxidative and inflammatory responses can be easily inducible, reproducible and visualized in their early stages of development. Furthermore, the in vivo zebrafish embryos and larvae assays have many of the advantages presented in vitro methods. The principal aim of this work was to evaluate the anti-inflammatory and anti-oxidant activity of natural substances present in the diet, with experimental models based on these substances´ screening on zebrafish. In this study, two experimental models were optimized and applied in zebrafish embryos and larvae. In the first model, the inhibitory effect on neutrophil migration in larvae was evaluated. In the second model, the protective effect on oxidative stress induced by exposure to an oxidizing agent was observed. Several carotenoids have been evaluated, including beta-carotene, lycopene and astaxanthin, phenolic compounds such as naringenin, cyanidin, curcumin, among others, as well as tomato sauce extract, one of the main ingredients of the Mediterranean diet. During the first model application, were used a 4 days’ post-fertilization zebrafish larvae and were optimized the experimental parameters. Results showed that most of the compounds used, including tomato sauce (sofrito), significantly reduce neutrophil migration compared to control group. The compounds that showed the greatest decrease on migration were: chlorogenic acid (66.7%), cyanidin (62.5%) respectively, while anti-inflammatory drugs (indomethacin, piroxicam) and NADPH oxidase inhibitor compounds (dibenzoidolium, apocynin) reduced neutrophil migration over 70%.

In contrast, no effect was observed when using the known non-anti-inflammatory drug amantadine. And in the case of the tomato sauce extract, it reduced 40% neutrophil migration.

The second model was previously developed in same laboratory by Boix, (2015). Have been determined the protective effect on oxidative stress with the same compounds in 0-48 hours- post-fertilization zebrafish embryos. It had been observed most compounds tested have a protective effect on the lethality, caused by the oxidative stress inducer tert-butyl hydroperoxide (tBOOH). In addition, a protective effect against morphological abnormalities was observed in cases of routine, apigenin and curcumin. It had been performed complementary studies of carotenoid permeability in zebrafish larvae using HPLC DAD UV, as well as gene expression analysis of pro-inflammatory cytokines (IL- 1β, IL-6 and TNF-α) by real-time PCR. In the first case it was verified that there is permeability of carotenoids in zebrafish larvae. In the second case, no significant differences were observed between the treated groups and the controls.