Drug repurposing of bioenergetic modulators: use in treatment and vaccination of protozoan parasitic diseases

Abstract

Las leishmaniasis, la tripanosomiasis Americana y Africana, y la malaria son enfermedades parasitarias que constituyen un importante problema de salud global que afecta mayoritariamente a países en desarrollo. El aumento del número de resistencias a sus tratamientos actuales, su toxicidad y la necesidad de asistencia sanitaria para la aplicación de los mismos reflejan la urgente necesidad de desarrollar vacunas eficaces y nuevos tratamientos económicos, fáciles de administrar y resistentes a condiciones de almacenamiento adversas. Basándonos en que estas enfermedades parasitarias comparten requerimientos metabólicos con patologías mejor estudiadas, proponemos el reposicionamiento de fármacos para tratarlas. Bajo esta premisa, seis fármacos de eficacia probada en la investigación contra el cáncer ―dicloroacetato (DCA), 3‐bromopiruvato (3BP), 2‐ deoxi‐D‐glucosa (2DG), lonidamina (LND), metformina (MET) y sirolimus (SIR)― fueron seleccionados por su habilidad para modular rutas metabólicas relacionadas con la producción de energía y proliferación. El objetivo de este estudio fue validar el uso de estos moduladores bioenergéticos para el control de la leishmaniasis visceral, malaria y tripanosomiasis americana y africana como tratamiento o como potenciadores de la protección de una vacuna frente a L. infantum. Para ello, se evaluó la eficacia de estos compuestos en modelos in vitro de cada parasito ―enfermedad de Chagas (Trypanosoma cruzi), tripanosomiasis Africana (Trypanosoma brucei), leishmaniasis visceral (Leishmania infantum) y malaria (Plasmodium falciparum)―. El 3BP y el DCA indujeron una reducción dosis‐dependiente del crecimiento de los amastigotes intracelulares de L. infantum con IC50 de 17.19 μM y 631.5 μM, respectivamente. En el modelo in vitro de T. brucei, todos los compuestos testados, a excepción de 2DG, afectaron a la viabilidad del parásito: DCA (IC50 = 1.24 mM), 3BP (IC50 = 76.57 μM), LND (IC50 = 26.76 μM), SIR (IC50 = 2.14 μM), y MET (IC50 = 17.30 Mm). En el caso de los amastigotes intracelulares de T. cruzi, DCA, 3BP, 2DG, LND, y MET tuvieron efecto parasiticida con valores de IC50 de 27.07 mM, 27.63 μM, 7.27 mM, 78.37 μM, y 18.48 mM, respectivamente. DCA (IC50 = 5.39 mM), 2DG (IC50 = 4.19 mM), LND (IC50 = 209.13 μM), MET (IC50 = 1.32 mM), y SIR (IC50 = 2.50 μM), mostraron efecto antiparasitario sobre trofozoitos de P. falciparum. Estos resultados sugieren que estos fármacos podrían ser útiles para tratar estas enfermedades parasitarias. Sin embargo, cuando los compuestos eficaces en los modelos in vitro fueron administrados en modelos in vivo de roedor para cada una de las enfermedades, ninguno de ellos contribuyó al control de la enfermedad o de la carga parasitaria. Los resultados obtenidos en el modelo de leishmaniasis visceral en hámster revelaron una disminución de la activación del sistema inmune en los animales tratados con DCA y 3BP, lo cual podría haber contribuido al fracaso del tratamiento. Por último, se estudió la capacidad del SIR para potenciar el efecto protector de una vacuna frente a la leishmaniasis visceral en el modelo hámster. Para ello se administró SIR durante la fase de expansión y contracción del sistema inmune producido por una vacuna de DNA portadora de los genes LACK, TRYP, PAPLE22, y KMPII de Leishmania, y se estudió la respuesta frente al posterior desafío con L. infantum. Los resultados muestran que la vacuna de DNA indujo la reducción eficaz de la carga parasitaria en piel (P = 0.0004) y linfonodos (P = 0.0452), lo cual potenció la administración del SIR alcanzándose también protección parasitológica en bazo (P = 0.0004). El estudio de los marcadores inmunológicos en dicho órgano sugiere que la producción controlada de IFN‐γ y el incremento en la expresión de FoxP3 podrían ser los responsables de la protección alcanzada.

Leishmaniases, African and American trypanosomiases and malaria are parasitic diseases that constitute a major global health problem. The increasing number of drug‐resistances to their current treatments, toxicity cases and the health assistance often required for their administration, makes it urgently necessary to develop efficient vaccines for humans and new affordable therapies, easy to apply and resistant to harsh storage conditions. Due to the fact that these diseases share similar metabolic requirements with better studied diseases, we chose drug repurposing as a potentially effective approach against them. With this purpose, six different compounds used in anti‐cancer research —dichloroacetate (DCA), 3‐bromopyruvate (3BP), 2‐deoxy‐D‐glucose (2DG), lonidamine (LND), metformin (MET), and sirolimus (SIR)— were selected according to their ability to modulate energy production and proliferation related metabolic pathways. The aim of this study was to validate the suitability of these bioenergetics modulators for the management of visceral leishmaniasis, malaria and African and American trypanosomiasis as a treatment, or as a preventive tool by enhancing the protective power of a vaccine against L. infantum. The effectiveness of these compounds was first evaluated on in vitro models of each parasite ― Chagas disease (Trypanosoma cruzi), human African trypanosomiasis (Trypanosoma brucei), visceral leishmaniasis (Leishmania infantum) and malaria (Plasmodium falciparum)―. L. infantum promastigotes were not susceptible to these compounds, whereas L. infantum intracellular amastigote growth was dose‐dependently reduced by 3BP (IC50 = 17.19 μM) and DCA (IC50 = 631.5 μM). In the T. brucei in vitro model all the tested compounds, with the exception of 2DG, affected parasite survival with IC50 values of 1.24 mM for DCA, 76.57 μM for 3BP, 26.76 μM for LND, 2.14 μM for SIR, and 17.30 mM for MET. In the case of T. cruzi, DCA, 3BP, 2DG, LND, and MET showed parasite‐killing activity with IC50 values of 27.07 mM, 27.63 μM, 7.27 mM, 78.37 μM, and 18.48 mM, respectively. For P. falciparum DCA (IC50 = 5.39 mM), 2DG (IC50 = 4.19 mM), LND (IC50 = 209.13 μM), MET (IC50 = 1.32 mM), and SIR (IC50 = 2.50 μM), showed antiplasmodial activity. These results reinforce the hypothesis that drugs with proven efficacy in the treatment of cancer by interfering with energy production might be useful in treating threatening parasitic diseases and provide new opportunities for their repurposing. However, when compounds that were effective in the in vitro approach were administered to the in vivo rodent models of these diseases, none of them contributed to disease management or parasite load control. Immunological analysis in the VL hamster model revealed a significant downregulation of immune‐activation in infected animals treated with DCA and 3BP, which may also contribute to treatment failure. In the last chapter of this work, the suitability of sirolimus as an immunomodulatory compound to boost the activity of a preventive vaccine against VL was analyzed. Sirolimus is an already marketed compound that has been described to boost immune protection against different disease models. In our study, Syrian hamsters were treated with sirolimus concomitantly with the administration of a plasmid DNA vaccine carrying the Leishmania genes LACK, TRYP, PAPLE22 and KMPII, and the subsequent response towards a L. infantum challenge was studied. Our results show that the DNA vaccine itself efficiently reduced the burden of parasites in skin (P = 0.0004) and lymph nodes (P = 0.0452), which was potentiated by SIR administration by also inducing parasitological protection in the spleen (P = 0.0004). The study of immune markers in spleen suggests that lower production of IFN‐γ and the concurrent increase of FoxP3+ expression may be responsible for the protection mediated by the DNA vaccine that was potentiated by sirolimus.