Desarrollo de aptasensores para la detección de bacterias enteropatógenas

Abstract

El objetivo general de esta tesis doctoral fue el desarrollo de biosensores basados en aptámeros para la detección de bacterias enteropatógenas. Para ello se estudiaron diferentes estrategias de detección gracias a las propiedades únicas de los aptámeros, tales como su capacidad de adoptar diferentes estructuras conformacionales tras el enlace con la molécula diana, su estabilidad y la facilidad con que se pueden modificar químicamente, introduciendo marcajes o ciertos grupos funcionales. Las bacterias utilizadas en todas las estrategias de detección fueron: Salmonella typhimurium (diana del aptámero seleccionado, específicamente las proteinas transportador ABC, OmpA y precursor OmpD), Eschericia coli O157 Shiga, Shigella sonnei, Escherichia coli k5, Proteus mirabilis, Bacillus cereus y Kocuria lutea.

En la primera fase de la tesis se realizó la caracterización de la bacteria Salmonella typhimurium y de la afinidad del aptámero por este microorganismo. La afinidad del aptámero por la bacteria se comprobó utilizando las técnicas de impresión por microcontacto (μCP), la microscopía de fuerza atómica (AFM) y la microscopía de fluorescencia. Posteriormente en la fase siguiente se desarrolló un sistema de detección basado en partículas magnéticas como plataforma de captura, preconcentración y detección basada en un ensayo competitivo indirecto. Se llevó a cabo la detección colorimétrica, por absorbancia, y electroquímica, por voltametría de pulso diferencial (DPV). En ambas alternativas de detección se observó reactividad cruzada de la bacteria Salmonella typhimurium con E. coli O157 Shiga y con Shigella sonnei, no presentándose dicha reactividad con las otras bacterias. El porcentaje de similitud de las proteinas diana análogas fue mayor en relación a las proteinas correspondientes a E. coli O157 Shiga y Shigella sonnei, y menor respecto a las proteinas análogas de las otras bacterias. En la tercera fase de la tesis se desarrollaron dos biosensores electroquímicos. Uno basado en la detección directa del enlace con la bacteria por espectroscopía de impedancia electroquímica (EIS). El otro biosensor se basó en la inhibición enzimática causada por el cambio conformacional del aptámero tras su enlace con la bacteria. En este caso se utilizó la técnica electroquímica DPV para medir la actividad de la enzima fosfatasa alcalina. Con el primero se lograron los mejores resultados, por cuanto los parámetros de comportamientos fueron los mejores (menor LOD, mayor sensibilidad, menor tiempo de análisis), pero además es una estrategia en la cual la construcción del aptasensor es simple puesto que consta de un solo paso. Finalmente los ensayos de selectividad llevados a cabo en todas las estrategias de detección muestran que todos los sistemas de detección fueron capaces de discriminar el grupo de bacterias clasificadas como enteropatógenos (Salmonella typhimurium, Escherichia coli O157 Shiga y Shigella sonnei) del resto de bacterias (Escherichia coli k5, Proteus mirabilis, Bacillus cereus y Kocuria lutea), demostrando que la afinidad del aptámero por Salmonella typhimurium no es específica para esta bacteria, sino que también existe una afinidad equivalente por E. coli O157 Shiga y Shigella sonnei.

The overall objective of this Thesis was to develop different biosensors based on aptamers to detect enteropathogen bacteria. This objective was accomplished through the study of different detection strategies which were proposed based on the unique properties of aptamers such as the capacity to present different conformational structures after linking to the target molecule, stability and ease of chemical functionalization.

The affinity of the aptamer against the Salmonella typhimurium was confirmed by Microcontact Printing (μCP), Atomic Force Microscopy (AFM) and Fluorescence Microscopy. Then, a magnetic particle detection system was developed as a capture, pre-concentration and detection platform based on an indirect competitive test. Colorimetric and electrochemical detection, using differential pulse voltammetry (DPV) were performed. In both detection alternatives, cross-reactivity of Salmonella typhimurium with Escherichia coli O157 Shiga and Shigella sonnei was observed, with no cross- reactivity with Proteus mirabilis, Bacillus cereus, Kocuria lutea and Escherichia coli k5.

In the next phase of the thesis, two electrochemical biosensors were developed, one based on the direct detection of the binding to the bacterium by electrochemical impedance spectroscopy (EIS) and the other based on the enzymatic inhibition caused by the conformational change of the aptamer after binding with the bacterium. In the second case the DPV technique was used to measure the activity of alkaline phosphatase. The best results were obtained with the impedance biosensor because as it showed improved behavior parameters (lower LOD, higher sensitivity and shorter analysis time). In addition, the construction of the aptasensor is simple as it consists of a single step.

Selectivity tests carried out on all detection strategies showed that the developed detection systems were able to discriminate the bacterial group classified as enteropathogens (Salmonella typhimurium, Escherichia coli O157 Shiga and Shigella sonnei) from other bacteria (Escherichia coli K5, Proteus mirabilis, Bacillus cereus and Kocuria lutea). Hence, the affinity of the aptamer for Salmonella typhimurium is not specific for this bacterium and there is also an equivalent affinity for E. coli O157 Shiga and Shigella sonnei.