Light-sensitive nanocarriers for drug delivery in photodynamic therapy

Abstract

Aquesta tesi aprofundeix en l’estudi de nanotransportadors com a sistemes de vehiculització i en alguns casos, alliberació de fotosensibilitzadors emprats en teràpia fotodinàmica. S’han fet servir dos nanotransportadors de naturalesa diferent: proteïnes i liposomes. En primer lloc s’ha investigat els complexos formats entre la hipericina i les proteïnes apomioglobina i β-lactoglobulina. S’han estudiat les característiques fisicoquímiques i fotofísiques, avaluant l’activitat antimicrobiana en front a bacteris gram-positius i gram-negatius. En ambdues matrius proteiques el fotosensibilitzador es troba majoritàriament en forma monomèrica, preservant les seves propietats fotofísiques i formant un complex estable. En el cas de la β-lactoglobulina s’estudia a més, la formació del complex amb l’adició d’un 20% de DMSO com a co-solvent, fet que millora les propietats fotofísiques en detriment de la capacitat antimicrobiana. Ambdós complexos proteics son efectius contra bacteris gram-positius però no contra gram-negatius. Per altra banda, es demostra que la hipericina incorporada a la cavitat de l’apomioglobina pot ser utilitzada en microscòpia de super-resolució STED. Amb aquesta tècnica es pot monitoritzar els llocs d’unió del fotosensibilitzador a la membrana dels bacteris. Així mateix, s’estudia l’ús de la β-lactoglobulina com a portador dual d’hipericina i àcid retinoic. En aquest últim sistema multi-component s’avaluen les propietats fotofísiques per a verificar la formació i estabilitat del complex. En segon lloc, es desenvolupa un nanovehicle per la seva aplicació en teràpia combinada en el qual s’incorporen fàrmacs quimioterapèutics convencionals amb agents fotosensibilitzants, per superar resistències i millorar l’eficàcia dels tractaments individuals. Amb aquest objectiu, s’han dissenyat i estudiat dues formulacions liposomals diferents, ambdues amb el mateix fotosensibilitzador però encapsulant diferents agents quimioterapèutics. Es preparen formulacions bimodals on s’incorporen els dos agents al mateix vehicle i els seus homòlegs unimodals, amb la incorporació única d’un dels dos agents. S’han avaluat les característiques fisicoquímiques, fotofísiques i fotobiològiques de les suspensions bimodals i unimodals. La lozalització subcel·lular demostra que cada principi actiu es localitza a orgànuls diferents desencadenant rutes de senyalització cel·lular diferents, eludint els possibles mecanismes de resistència. El tractament in vitro en cèl·lules cancerígenes amb aquests sistemes tenen un efecte prometedor, ja que com a mínim presenten un comportament additiu respecte els tractaments individuals. Finalment, s’ha avaluat el potencial de la vehiculització activa mitjançant la unió covalent d’un anticòs monoclonal a la superfície, el que millora lleugerament els resultats per una de les dues formulacions.

Esta tesis profundiza en el estudio de nanotransportadores como sistema de vehiculización y en algunos casos, liberación de fotosensibilizadores empleados en terapia fotodinámica. Se emplean dos nanotransportadores de naturaleza distinta: proteínas y liposomas. En primer lugar se han investigado los complejos formados entre hipericina y las proteínas apomioglobina y β-lactoglobulina. Se han estudiado las características fisicoquímicas y fotofísicas, evaluando la actividad antimicrobiana frente bacterias gram-positivas y gram-negativas. En ambas matrices proteicas el fotosensibilizador se encuentra mayoritariamente en forma monomérica, preservando sus propiedades fotofísicas y formando un complejo estable. En el caso de la β-lactoglobulina se estudia además, la formación del complejo con la adición del 20% de DMSO como co-solvente, lo que mejora las propiedades físicas pero sorprendentemente, empeora la capacidad antimicrobiana. Ambos complejos proteicos son efectivos contra bacterias gram-positivas, pero no contra gram-negativas. Además, se demuestra que la hipericina en la cavidad de la apomioglobina es capaz de realizar microscopía de super-resolución STED, mediante la cual se puede monitorizar los sitios de unión a las bacterias. Asimismo, se ha estudiado la β-lactoglobulina como portador dual de hipericina y ácido retinoico. En este último sistema multi-componente se evalúan las propiedades fotofísicas para verificar la formación y estabilidad del complejo. En segundo lugar, se desarrolla un nanovehículo para su uso en terapia combinada en el que se incorpora fármacos quimioterapéuticos convencionales con agentes fotosensibilizantes, para superar las resistencias y mejorar la eficacia de los tratamientos individuales. Con este objetivo, se han diseñado y estudiado dos formulaciones liposomales diferentes, ambas con el mismo fotosensibilizador, pero con diferentes agentes quimioterapéuticos. Se preparan las formulaciones bimodales con ambos agentes en el mismo vehículo además de sus homólogos unimodales, con la incorporación única de uno de los dos agentes. Se han evaluado las características fisicoquímicas, fotofísicas y fotobiológicas de las suspensiones bimodales y unimodales. La localización subcelular demuestra que cada principio activo se localiza en orgánulos diferentes desencadenando rutas de señalización celular diferentes, eludiendo los posibles mecanismos de resistencia. El tratamiento in vitro en células cancerígenas de estos sistemas tiene un efecto prometedor siendo al menos aditivo en comparación con los tratamientos individuales. Finalmente, se ha evaluado el potencial de la vehiculización activa mediante la unión covalente de un anticuerpo monoclonal en la superficie, lo que lleva a resultados ligeramente superiores para una de las dos formulaciones.

This thesis reports the study of nanocarriers as drug delivery systems for photosensitisers in photodynamic therapy. Proteins and liposomes are the two nanovehicles of different nature used for this purpose. Beginning with the proteins, the complexes formed between hypericin and the proteins apomyoglobin and β-lactoglobulin have been explored. The physicochemical and photophysical properties have been studied, as also assessing their photoantibacterial activity against Gram-positive and Gram-negative bacteria. In both protein scaffolds the photosensitiser is found mainly in monomeric form, preserving its fluorescence and singlet oxygen photosensitising properties and yielding a stable complex. In the case of β-lactoglobulin, the complex formation has also been tested with the addition of a 20% DMSO as a co-solvent, which improves the photophysical properties but surprisingly, worsens its antimicrobial activity. Both protein complexes are effective against Gram-positive but not against Gram-negative bacteria. Moreover, it has been proved that hypericin, inside the apomyoglobin cavity, can perform STED microscopy through which its localization in bacteria can be monitored. Additionally, the suitability of β-lactoglobulin as a dual carrier for hypericin and acid retinoic has also been exploited. In this last multi-component system, the photophysical properties have been evaluated to confirm the formation and complex stability. Secondly, a nanocarrier for its use in combined therapy has been developed, in which conventional chemotherapeutic drugs are combined with photosensitising agents to overcome resistance and improve the effectiveness of the individual treatments. For this purpose, two different liposome formulations have been designed and studied with a common photosensitiser but different anti tumour drugs. The bimodal formulations with both agents entrapped and their unimodal counterparts, having each drug loaded in separate liposomes, have been evaluated. The physicochemical, photophysical and photobiological properties of bimodal and unimodal suspensions have been studied. The subcellular localization shows different organelle accumulation by each agent, triggering different key signals transduction pathways, eluding the cellular resistance mechanisms. The treatment in vitro of these multi-component liposomes with cancer cells has a promising effect, since at least an additive outcome is observed when compared with the individual treatments. Finally, we have explored the potential of active targeting strategies by covalently linking a monoclonal antibody to the surface, leading to slightly greater outcomes for one of the liposomal formulations.