Model animal de malalties associades a canals de clorur en peix zebra

Abstract

El clorur compleix un conjunt de funcions essencials perquè la cèl·lula pugui realitzar correctament diferents processos fisiològics, com la regulació de l’excitabilitat en les cèl·lules musculars, participa en el transport transepitelial d’aigua i sals, en la regulació del pH en l’interior dels lisosomes i en la regulació del volum cel·lular, entre d’altres. La família de proteïnes ClC es divideix en dos grups: en canals iònics presents en la membrana plasmàtica i en transportadors Cl-/H+ presents en compartiments intracel·lulars. Fins ara s’ha descrit que ClC-2, els dos canals ClC-K i ClC-7 presenten les subunitats accessòries anomenades GlialCAM, Barttin i Ostm1, respectivament. En aquesta tesi s’han estudiat els canals iònics de membrana plasmàtica ClC-1, ClC-2 i els canals ClC-K. Mutacions en els gens que codifiquen aquestes proteïnes donen lloc a malalties rares en humans i altres espècies animals, com la Miotonia congènita (degut a la pèrdua d’activitat ClC-1, es caracteritza per un retard en la repolarització muscular), un tipus rar de leucodistròfia vacuolitzant (degut a la pèrdua de ClC-2) i síndrome de Bartter tipus III (degut a la pèrdua de ClC-Kb). En aquesta tesi hem identificat i iniciat la caracterització dels gens ClC ortòlegs en el peix zebra. Hem estudiat el patró d’expressió tant en adults com en embrions. En adults, hem descrit que els canals clcn1a i clcn1b són específics de múscul esquelètic, el canal clcn2a és el més abundant en teixits excitables com el cervell, ull i cor; el canal clcn2b és ubic, el canals clcn2c s’expressa en teixits on es dóna intercanvi iònic amb el medi extern com les brànquies i el ronyó i el canals clcnk s’expressa en el ronyó. En embrions, només hem pogut estudiar la localització de clcn2b, el qual s’expressa en el túbul contornejat proximal del pronefros, i de clcn2c, el qual s’expressa en la regió dels arcs branquials. Hem detectat expressió dels gens clcn1a i clcn1b a partir de 1dpf i 2dpf, respectivament. Part important de la tesi ha estat la generació i validació d’anticossos policlonals tant pels canals clc-1a, clc-1b, clc-2a, clc-2b, clc-k com per les subunitats glialcama i barttin. També hem demostrat in vitro que es conserva la interacció dels canals clc-2 amb GlialCAM, modificant el seu tràfic a les unions cel·lulars i les corrents. De la mateixa manera, el paper estabilitzador de Barttin sobre els canals ClC-K també es troba conservat en el peix zebra. Estudis d’immunofluorescència en larves de peix zebra a 3dpf mostren una localització cel·lular diferent en el múscul esquelètic, mentre que clc-1a es localitza al sarcolema, clc-1b es troba envoltant els túbuls T. A més, hem desenvolupat eines de transgènesi amb promotors específics de teixit per tal de realitzar experiments d’expressió en múscul esquelètic (503unc) de proteïnes de fusió fluorescents (tant humanes com de peix zebra). Una part important d’aquest treball ha estat la generació de models de pèrdua de funció en peix zebra mitjançant la tecnologia CRISPR/Cas9. Hem aconseguit generar animals knock out dels gens clcn1a i clcn1b (el doble knock out encara està en procés), els quals han estat validats com a tal gràcies als anticossos generats durant aquesta tesi. Finalment, hem realitzat uns estudis locomotors preliminars i aquests mostren com les línies mutants per clcn1a i per clcn1b no presenten cap alteració en el moviment espontani ni en la resposta a estímuls de vibració. És probable que la manca d’un dels dos canals clc-1 sigui compensada pel seu paràleg, per aquesta raó estem generant una línia nul·la pel canal clc-1. En aquesta línia deficient per clc-1 esperem detectar alteracions motores reminiscents a les observades en pacients de Miotonia congènita.

Chloride is the most abundant anion in body fluids. Chloride transport is involved in many different cellular processes, such as regulating the excitability of muscle cells, transepithelial transport and regulation of pH in lysosomes, among others. The ClC protein family comprises a group of proteins allowing this exchange between the intracellular and extracellular space. They are divided into two subgroups: the plasma membrane chloride channels and the Cl-/H+ co-transporters located in intracellular compartments. The plasma membrane chloride channels are ClC-1 (muscle-specific, is in charge of keeping the resting membrane potential in muscle cells), ClC-2 (ubiquitously expressed) and ClC-Ka and ClC-Kb (located in the distal renal tubule and inner ear, involved in renal salt reabsorption and sound transduction in the ear). Mutations in the genes encoding for these channels lead to human rare diseases. Loss of ClC-1 leads to Myotonia congenital resulting in hyperexcitable muscles, lack of ClC-2 leads to a rare type of vacuolating leukodystrophy and the loss of ClC-Kb leads to Bartter syndrome type III, which is characterized by renal salt loss. In this thesis, we have identified and characterized the zebrafish (Danio rerio) ClC orthologs. To accomplish that, we have generated and validated antibodies against the zebrafish proteins. Furthermore, we have developed transgenesis tools for native and mutant proteins expression experiments and generated clcn1a and clcn1b (human CLCN1 orthologs) loss-of-function alleles in zebrafish with CRISPR/Cas9 technology (the clcn1 null-mutant is in progress). We have validated these lines as knock out and a preliminary locomotor characterization shows these animals display normal spontaneous movement and no difference has been observed between wild-type and knock out animals when applying vibrational stimulus. We hope for the clcn1a-/- clcn1b-/- to show locomotor deficiencies reminiscent to those observed in Myotonia congenita patients.