Péptidos sintéticos del GB virus C. Aplicación en el diagnóstico de infección y en el diseño de potenciales agentes terapéuticos contra el VIH-1

Abstract

El GB virus C (GBV-C), también conocido como virus de la hepatitis G, es un virus humano no patogénico. Su infección es bastante frecuente, encontrándose incluso en personas sanas. Su prevalencia es mucho mayor en individuos considerados de riesgo, ya que comparte las vías de transmisión con otros virus, como por ejemplo con el virus de la hepatitis B, el virus de la hepatitis C o el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Numerosos estudios asocian la coinfección del GBV-C y el VIH con una menor progresión de la enfermedad y con una mayor supervivencia de los pacientes una vez que el SIDA se ha desarrollado. Sin embargo, el mecanismo de acción aún no se ha determinado. De este modo, el estudio de la interacción entre ambos virus podría dar lugar a nuevos agentes terapéuticos para el tratamiento del SIDA. Por otro lado, en cuanto al diagnóstico, actualmente no existe ningún sistema comercial para detectar marcadores específicos de la infección causada por el GBV-C. De esta manera, en esta tesis se ha estudiado la capacidad de diversas moléculas peptídicas de regiones de la proteína de envoltura E2 y de la proteína no estructural NS4a del GBV-C para inhibir la entrada del VIH-1 a la célula, con el fin de conocer su potencial aplicación como agentes terapéuticos contra dicho virus. Asimismo, se ha estudiado la utilidad de dichas construcciones para desarrollar nuevos sistemas de diagnóstico de la infección causada por el GBV-C, empleando el ensayo inmunoenzimático de ELISA y la técnica de microarrays. En primer lugar, se ha realizado un estudio detallado de la proteína E2 del GVB-C mediante la preparación de microarrays peptídicos con 124 secuencias lineales de dicha proteína. Para ello, se han empleado sueros procedentes de pacientes infectados por el VIH-1, de los cuales se conocía la presencia o ausencia de anticuerpos anti-E2 del GBV-C, y sueros de personas voluntarias sanas. Este ensayo ha permitido identificar dominios potencialmente antigénicos de la proteína E2 del GBV-C. Teniendo en cuenta los resultados obtenidos y estudios previos realizados en el grupo de investigación, se ha llevado a cabo la síntesis de moléculas peptídicas derivadas del dominio N-terminal de la proteína E2 del GBV-C. Por un lado, se ha realizado la síntesis en fase sólida siguiendo una estrategia Fmoc/tBu, de péptidos lineales y de MAPs tetraméricos de tipo lineal homogéneo (con cuatro secuencias peptídicas iguales) y de tipo lineal heterogéneo (con secuencias peptídicas iguales dos a dos). También se han sintetizado péptidos cíclicos en solución mediante la reacción de transtioesterificación intramolecular conocida como Ligación Química Nativa. Por último, se ha llevado a cabo la formación de MAPs tetraméricos de tipo cíclico mediante ligación quimioselectiva en solución. Todas las moléculas sintetizadas se han caracterizado por HPLC, UPLC y espectrometría de masas (ESI y MALDI-TOF) y se han purificado por HPLC semipreparativo. Posteriormente, se han realizado ensayos de fusión celular con el fin de evaluar la actividad anti-VIH-1 de las moléculas peptídicas que derivan del dominio N-terminal de la proteína E2 del GBV-C. Las líneas celulares empleadas fueron la Hela-env y la TZM-bl. De este estudio pudo concluirse que las construcciones de tipo cíclico tienen mayor tendencia hacia una mayor inhibición de la entrada del VIH-1 en la célula. Se ha estudiado la capacidad para detectar anticuerpos anti-GBV-C de todas las secuencias y construcciones sintéticas mediante el ensayo inmunoenzimático de ELISA con sueros procedentes de pacientes con hepatitis C crónica, de pacientes sometidos a hemodiálisis, infectados con VIH-1 y sueros de donantes voluntarios sanos. Los resultados obtenidos demostraron la potencial utilidad diagnóstica de la región E2(7-26) del GBV-C. Por último, con un panel de sueros de pacientes infectados por el VIH-1, del que no se tenía información sobre la presencia o ausencia de anticuerpos anti-E2 del GBV-C, se ha evaluado el valor diagnóstico de los dominios peptídicos identificados mediante microarrays. La combinación de las secuencias peptídicas ensayadas ha permitido establecer una reactividad del 47% en cuanto a la detección de anticuerpos anti-E2 del GBV-C en personas infectadas por el VIH-1. Además, esta tecnología ha miniaturizado el ensayo inmunoenzimático de ELISA y ha demostrado la utilidad de los péptidos sintéticos como potenciales antígenos para el desarrollo de un sistema de diagnóstico de la infección del GBV-C.

GB virus C (GBV-C) (also formerly known as hepatitis G virus) is a non-pathogenic human virus. Its infection is more frequently in groups considered as high risk because it has similar routes of transmissions with other viruses such as hepatitis B virus, hepatitis C virus or human immunodeficiency virus (HIV). However, it is detected even in healthy people. There is a strong evidence for GBV-C association with ameliorated course of human immunodeficiency virus (HIV) disease, although its mechanism of action is yet to be determined. Thus, the study of the interaction between these viruses could give new therapeutic agents to HIV treatment. At present, there are no commercial systems to detect specific markers of GBV-C infection.

In this thesis, the synthesis of branched peptide molecules was carried out by conjugating regions of the envelope protein E2 and the structural protein NS4 of the GBV-C virus. Afterwards, their antigenic capacity was evaluated. The ability of the synthesized molecules to inhibit cell fusion mediated by HIV-1 envelope protein was also studied in order to select potential inhibitors of virus entry into the cell.

First of all, a detailed study of the E2 protein of GVB-C was carried out by preparing peptide microarrays with 124 linear sequences of this protein, using sera from patients infected with HIV-1 and healthy volunteers. Thus, potentially antigenic domains of the E2 protein of GBV-C were identified. After carrying out these assays and studying the accessibility profile of the potentially antigenic domain E2 (7-26), solid phase synthesis of linear, cyclic and branched peptides was carried out following an Fmoc/tBu strategy. Peptide constructions were characterized by HPLC, UPLC and mass spectrometry (ESI and MALDI-TOF) and purified by semipreparative HPLC.

Subsequently, cell fusion assays were performed in order to evaluate the anti-HIV-1 activity of the peptide molecules derived from the N-terminal domain of the E2 protein of GBV-C. From this study, it could be concluded that the cyclic type constructions have a greater tendency towards a greater inhibition of HIV-1 entry in the cell.

The ability to detect anti-GBV-C antibodies of all sequences and synthetic constructions were studied by the ELISA immunoenzymatic assay with sera from patients with chronic hepatitis C, patients undergoing hemodialysis, HIV-1 infected and sera from healthy volunteer donors. The results obtained demonstrated the potential diagnostic utility of the E2 region (7-26) of the GBV-C.

Finally, the diagnostic value of the peptide domains identified by microarrays was evaluated with a panel of sera from patients infected with HIV-1. The combination of the peptide sequences studied allowed to establish a reactivity of 47% in the detection of anti-E2 antibodies of GBV-C in people infected with HIV-1. In addition, this technology has miniaturized the ELISA immunoenzymatic assay and it has demonstrated the usefulness of synthetic peptides as potential antigens for the development of a GBV-C infection diagnosis system.