Exosomes i microRNAs en biòpsia líquida com a biomarcadors pronòstic del càncer de colon

Abstract

El càncer de colon (CC) és el tercer tipus de càncer més freqüent a nivell mundial i representa la segona causa de mort per càncer en homes i la tercera en dones. La majoria dels CC tenen un origen esporàdic a partir d’un pòlip benigne que progressa a un adenocarcinoma maligne degut a l’acumulació successiva de determinats canvis genètics i epigenètics. El principal factor pronòstic per la recaiguda i la supervivència en el CC és l’estadiatge de la malaltia, essent l’estadi III el que està associat a major risc de recaiguda i pitjor supervivència. El tractament més adequat en funció de les característiques clinicopatològiques de cada pacient és una qüestió controvertida i en constant evolució, sobretot pels pacients en estadi II. Per això actualment està adquirint gran importància l’estudi de nous biomarcadors pronòstic, com els exosomes i els RNAs no codificants petits (microRNAs), mitjançant biòpsia líquida i obtinguts a partir de les venes més pròximes al tumor, per tal de dissenyar un tractament personalitzat més eficient. Els exosomes són vesícules extracel·lulars (30-100nm) que poden afavorir el desenvolupament tumoral mitjançant la transferència de molècules empaquetades en el seu interior, com microRNAs i proteïnes, a les cèl·lules normals receptores. S’ha descrit que més del 40% del contingut exosomal correspon a microRNAs, l’expressió anòmala dels quals s’ha relacionat clàssicament amb el procés tumoral. El treball presentat ens ha permès valorar la utilitat dels exosomes i els microRNAs com a biomarcadors pronòstic en el CC. En el primer estudi amb mostres de pacients de CC, s’ha obtingut que alts nivells de miR-21 en la vena que drena directament el tumor primari, la vena mesentèrica (VM), s’associen a un pitjor pronòstic en termes de supervivència lliure de malaltia. Aquests resultats s’ampliaren al realitzar un array amb 754 microRNAs en VM i vena perifèrica (VP) de pacients quirúrgics de CC d’estadis I-III amb el qual s’obtingué un perfil de 4 microRNAs associats a valor pronòstic: let-7g, miR-15b, miR-155 i miR-328. Alts nivells de let-7g, miR-15b, miR-155 i miR-328, en VM s’associen a pitjor pronòstic en termes de temps a la recaiguda, mentre que, de forma interessant, s’obtenen resultats inversos a l’analitzar tals microRNAs en VP. Aquests resultats suggereixen que el tumor primari de colon allibera altes concentracions de microRNAs i exosomes a través de la VM i aquests nivells queden relativament diluïts en la circulació perifèrica. Aquest fet destaca la importància d’obtenir marcadors sanguinis abans de colonitzar l’òrgan diana. A continuació es van aïllar i caracteritzar exosomes de VM i VP dels pacients de la sèrie estudiada. Es va confirmar la presència de let-7g, miR-15b, miR-155 i miR-

328 en el seu interior mitjançant PCR quantitativa a temps real. El subgrup de pacients que va desenvolupar metàstasi presenta alts nivells de miR-328 exosomal en la VM. En base a aquests resultats previs, es procedeix a indagar l'efecte de miR-328 sobre els seus gens diana putatius per aprofundir en el mecanisme molecular que exerceix miR-328 durant el procés carcinogènic del CC. S'ha pogut comprovar que miR-328 inhibeix directament SLC2A1 / GLUT1 en dues línies cel·lulars de CC, LOVO i SW480, suggerint que miR-328 podria ser un element clau per modular les característiques metabòliques del microambient i afavorir la formació del nínxol pre-metastàsic, probablement participant en el desenvolupament de l'efecte Warburg. Finalment es va realitzar un anàlisi proteòmic dels exosomes de VM i VP dels pacients de la sèrie estudiada. Els resultats obtinguts mostren que els pacients recaiguts presenten alts nivells de la proteïna ECM1 exosomal en la VM i aquests s’associen a valor pronòstic.

Colon cancer (CC) is the third most common cancer worldwide. The main prognostic factor for relapse and survival is disease stage, and patients with stage III disease have a higher risk of relapse than those with stage II. Surgery is the standard treatment for stage I to III, and adjuvant treatment has been shown to be effective in stage III but less so in stage II. Consequently, the study of new prognostic and predictive biomarkers, such as exosomes and small non-coding RNAs, such as microRNAs (miRNAs), obtained from the tumor-draining vein can provide a useful tool for selecting treatment and improving outcome in these patients. In the present study, we have examined the role of exosomes and miRNAs as prognostic markers in CC. In a previous study, we examined the expression levels of the common oncogenic miRNA miR-21 in plasma samples from the tumor-draining mesenteric vein (MV) of CC patients and found that those with high expression had worse prognosis than those with low expression. In order to further explore this finding, we profiled the expression of 754 miRNAs in plasma samples taken from the MV and peripheral vein (PV) of surgically resected stage I-III CC patients. We found that let-7g, miR-15b, miR-155 and miR-328 in MV plasma were associated with shorter time to relapse. Interestingly, inverse results were obtained when analyzing the same miRNAs in PV plasma, highlighting the importance of obtaining blood biomarkers before they colonize the target organ. Next, we isolated and characterized exosomes from MV and PV and confirmed the presence of let-7g, miR-15b, miR-155 and miR-328 in exosomes. The subgroup of patients who developed metastases had high levels of exosomal miR-328 in MV. Based on these results, we proceeded to investigate the effect of miR-328 on its putative target genes during the development of CC. We found that miR-328 directly inhibits SLC2A1/GLUT1 in the LOVO and SW480 CC cell lines, suggesting that miR-328 could play a key role in modulating the metabolic characteristics of the microenvironment to induce the formation of the premetastatic niche. Finally, we performed a high throughput proteomic analysis in exosomes isolated from MV and PV from the same cohort of patients and found that relapsed patients showed high levels of ECM1 exosomal protein in the MV, which was associated with poor prognosis.