Expresión de moléculas pro-inflamatorias en modelos caninos de inflamación alérgica in vivo e in vitro

Abstract

La dermatitis atòpica (DA) és l'expressió clínica d'un procés al.lèrgic en la pell que es manifesta en individus atòpics que entren en contacte amb un al.lergè en front al qual són hipersensibles. La DA es manifesta en l'home i en el gos per l'aparició sobtada de picor i de lesions cutànies immediates (fase primerenca o EAR). A més a més, en un percentatge elevat de pacients, la malaltia evoluciona cap a una fase tardana (LAR) que es sustenta en un procés inflamatori responsable possiblement dels símptomes crònics de la malaltia. En la DA humana i canina la inflamació es constitueix majoritàriament de cèl.lules dendrítiques i limfòcits T. En ambdues espècies s'ha demostrat que la resposta immunitària és inicialment de tipus Th2 i a mesura que la malaltia es fa crònica esdevé de tipus Th1. Durant el reclutament de les cèl.lules inflamatòries, s'activen entre d'altres, les molècules d'adhesió. Probablement en aquesta activitat participen els mastòcits (MC) de la dermis. La població mastocitària es col.loca en un lloc privilegiat per a coordinar el procés inflamatori per la seva situació anatòmica pròxima als vasos sanguinis i pel seu contingut en mediadors pro-inflamatoris. El coneixement dels mecanismes d' instauració de la inflamació en la DA és fonamental per a establir estratègies terapèutiques encaminades a reduir-la. Ens proposàrem estudiar l'expressió de la selectina P, l'ICAM-1 i el TNF-a en la DA, així com la contribució dels MC a la seva inducció en models canins in vitro i in vivo.<br/>Es van seleccionar gossos amb DA espontània en l'Hospital Clínic Veterinari de la Universitat Autònoma de Barcelona i es van tractar amb antibiòtics. Mitjançant immunohistoquímica, en les lesions cutànies es va observar una major expressió de selectina P que en les zones no lesionades. Aquest augment es correlacionava amb una adherència incrementada dels leucòcits a l'endoteli vascular. A més a més, mitjançant estudis in vitro amb línies cel.lulars de MC canins i cèl.lules endotelials de caròtida canina, vam demostrar que els mediadors mastocitaris són capaços d'induir l'expressió de selectina P endotelial. Això suggereix una relació funcional entre els MC i les cèl.lules endotelials de la dermis en la DA durant l'establiment del procés inflamatori, i pot reflexar la importància de la selectina P en les fases inicials de la inflamació al.lèrgica. Es va avaluar també l'expressió de TNF-a i ICAM-1 en gossos amb DA espontània. No es va observar un augment significatiu de cap d'aquestes dues molècules en las zones lesionades, però les dades suggereixen que existeix una tendència a la sobre-expressió d'ambdues. També es va observar que en la pell canina els MC són la font fonamental de TNF-a i es va comprobar mitjançant estudis in vitro que el TNF-a mastocitari és capaç d'induir l'expressió d'ICAM-1 endotelial. De nou s'estableix una relació funcional de l'eix MC / TNF-a / ICAM-1 endotelial que pot ser important en la patogènia de la inflamació al.lèrgica en la DA, encara que es requereix de nous experiments per a determinar la seva contribució al procés inflamatori. Les dificultats que impliquen els estudis en gossos amb DA natural i l'interés per avaluar el paper dels MC en aquest procés in vivo, ens va portar a contribuir a la caracterització d'un model caní de dermatitis al.lèrgica: el gos hipersensible a Ascaris suum. La injecció intradèrmica d'antigen (Ag) purificat d'Ascaris indueix una reacció immediata (pàpula) de la que són responsables majoritaris els MC. Vam observar que, a més, es produeix una inflamació en la dermis molt similar a la que s'observa en l'home. En l'establiment del procés inflamatori en aquest model juga un paper important la selectina P, de la que probablement els MC en siguin els inductors.<br/>En pell lesionada de gossos amb DA els MC poden ser els responsables de l'expressió de selectina P i d'altres molècules d'adhesió com l'ICAM-1 mitjançant l'alliberació de mediadors pro-inflamatoris com el TNF-a. Un procés inflamatori similar en el que probablement també participen els MC s'observa en el model de gos hipersensible a Ascaris en fer la injecció intradèrmica d'Ag. Aquest model suposa per tant un sistema biològic idoni per a caracteritzar la inflamació al.lèrgica en DA i mitjançant el protocol de sensibilització primària transcutània que hem establert hi haurà més accessibilitat a aquest model d'al.lèrgia cutània canina.

Atopic dermatitis (AD) is an allergic skin condition occurring in predisposed atopic individuals upon contact with an allergen. AD develops in humans and dogs, and appears clinically as an immediate cutaneous lesional reaction and pruritus, the so-called early allergic reaction (EAR). In many individuals, this evolves towards a late allergic reaction (LAR) with an underlying inflammatory process. In both species, human and canine, the primary cells in the inflammatory infiltrate are dendritic cells and T lymphocytes. Also the process switches from a Th2 to a Th1 response along the course of the disease. The cell recruitment is conducted by adhesion molecules and other pro-inflammatory cytokines possibly released by the dermal mast cells (MC) because of their prvivileged location close to the endothelial cells were this migration process takes place. The understanding of the mechanisms leading to allergic inflammation is of outmost relevance to establish future therapeutic strategies. We proposed to study the expression of P-selectin, ICAM-1 and TNF-a in AD and to assess the contribution of MC in canine in vitro and in vivo models.<br/>Dogs with spontaneous AD were selected at the Veterinary Teaching Hospital of the Universitat Autònoma de Barcelona. Immunohistochemistry revealed that lesional skin from these dogs had an over-expression of P-selectin when compared to non-lesional skin. This was paralleled by an increased adherence of leukocytes to the vascular endothelium. We also demonstrated in in vitro studies that canine MC were able to up-regulate P-selectin on the carotid endothelial surface. Altogether, this suggests a functional relation between MC and endothelial cells that might be relevant to P-selectin up-regulation in AD. We also assessed the expression of ICAM-1 and TNF-a but no over-expression was detected under our conditions. However, given that the counting showed a higher expression in the lesional sites, we concluded that there is a trend towards an increased expression of both pro-inflammatory molecules. We also observed that MC are the primary soruce of TNF-a in the skin and that, in vitro, such TNF-a is the main inductor of the up-regyulation of ICAM-1 in canine carotid endothelial cells. This in turn suggests a functional relation of the axis MC/TNF-a/ICAM-1 that might be important in the inflammatory process underlying AD. Given the problems associated to the study of the natural disease in dogs, we further characterized a canine model of AD that can provide insights on the relevance of MC to its pathogenesis: the Ascaris suum hypersensitive dog. In this model, the Ag i.d. injection triggers the release of MC vasoactive mediators responsible for the early wheal reaction. In addition, we observed an inflammatory process similar to the one in humans. P-selectin appears to contribute to such process as for the expression in the lesional skin revealed by immunhistochemistry.<br/>All this points at a potential role of MC in the LAR through the release of pro-inflammatory mediators such as TNF-a that do up-regulate the expression of adhesion molecules. Among these, P-selectin appears to bear a leading role in the induction of inflammation in AD and should be foreseen as a target when considering new management approaches. This was confirmed by our studies in the Ascaris suum hypersensitive canine model. The potential of such unique model increased in particular since we also propose a way to induce it rather than select the hypersensitive animals.