Technological insights into a histopathological and protein composition analysis of aortic aneurysms in Marfan syndrome

Abstract

The aorta is the main artery of the body, whose function is to collect the blood ejected by the heart and distribute it to all tissues. The elastic degree of the aortic wall necessary to withstand blood pressure is mainly provided by the distribution of collagen fibres and elastic lamellae. Fibrilin-1 is an essential protein of the elastic lamellae, which is mutated in Marfan syndrome (MFS), a connective tissue disorder characterized by the formation of aortic aneurysms with a high risk of mortality. Multiphoton microscopy and the microCT, among other approaches, have been used to evaluate the structural characteristics of the aortic tissue, the but there is currently little information about the three-dimensional histopathological structure of the MFS aorta. Besides, the differences in the protein content with respect to the healthy aorta have been analysed by means of studies that used conventional cell culture, neglecting the effect of the mechanical forces that the vascular smooth muscle cells (VSMC) constantly perceive in vivo due to blood pressure. In this context, we have developed four innovative technologies that have allowed us to generate new data on the histopathological structure and the protein content of the aorta MFS in comparison to healthy samples: - A multiphoton microscopy and image processing methodology was applied to MFS mouse aortae to visualise and analyse the microscale morphology of the elastic lamellae. Bigger and more abundant fenestrae were observed in the aorta of MFS compared to those of the WT. With this results, fenestrae become potential markers of lamellar damage in MFS. - A microCT and image processing protocol to evaluate the histological integrity of the aortic wall. This technology was applied to MFS and WT mice aortae, and an increase in the area and the thickness of the tunica media and other histological parameters was observed in relation to age progression (3, 6, and 9 months (mo)). This increase was parallel between WT and MFS, but the SMF 9mo showed values significantly higher than the WT 9m. Therefore, we hypothesise that the MFS aorta may undergo an accelerated middle-ageing process. - A bioreactor of mechanical stretching to examine the protein content of VSMCs of healthy human aorta and MFS cultivated under in vivo-like mechanical conditions. The MFS cells showed an altered reaction to the administration of stretch, not related to the content or distribution of phenotypic markers. Therefore, the MFS VSMCs show altered cell-matrix communication not linked to the phenotype. - Finally, by means of the systematic review of the scientific literature, the most complete human aortic tissue proteome to date was generated. It is divided into a healthy and an aneurysmal databases, containing 919 and 724 different proteins, respectively. The application of these technologies has provided new knowledge in the field of vascular biology, especially with regard to Marfan syndrome.

L'aorta és la principal artèria del cos, la funció de la qual és recollir la sang expulsada pel cor i distribuir-la cap a tots els teixits. El grau elàstic de la paret aòrtica necessari per a suportar la pressió sanguínia ve donat principalment per la distribució de fibres de col·lagen i lamel·les elàstiques. La fibrilina-1 és una proteïna essencial de les lamel·les elàstiques, la qual es troba mutada en la síndrome de Marfan (SMF), un trastorn del teixit connectiu caracteritzat per la formació d’aneurismes d’aorta amb alt risc de mortalitat. Per a avaluar les característiques estructurals del teixit aòrtic s’han utilitzat, entre d’altres, la microscòpia multifotó i el microCT, però avui encara hi ha poca informació sobre l'estructura histopatològica tridimensional de l'aorta SMF. D'altra banda, s’han analitzat les diferències en el contingut proteic respecte l’aorta sana mitjançant estudis que empraven cultiu cel·lular convencional, descuidant l'efecte de les forces mecàniques que les cèl·lules musculars llises vasculars (VSMC) perceben constantment in vivo a causa de la pressió arterial. En aquest context, hem desenvolupat quatre tecnologies innovadores que han permès generar noves dades sobre l'estructura histopatològica i el contingut proteic de l'aorta SMF en comparació a mostres sanes: - Una metodologia de microscòpia multifotó i de processament d'imatges es va aplicar a aortes de ratolins SMF per a visualitzar y analitzar la morfologia microscala de les lamel·les elàstiques. Es van observar fenestres més grans i abundants en l'aorta de SMF en comparació amb les del tipus WT; esdevenint les fenestres potencials marcadors del dany lamel·lar en la SMF. - Un protocol de microCT i processament d'imatges per a avaluar la integritat histològica de la paret aòrtica. Aquesta tecnologia es va aplicar a aortes de ratolins SMF i WT, i es va observar un increment de l'àrea i el gruix de la túnica media i d’altres paràmetres histològics en relació amb la progressió en edat (3, 6 i 9 mesos (mo)). Aquest increment fou paral·lel entre WT i SMF, però el SMF 9mo mostrà valors significativament més alts que els WT 9mo. Per tant, plantegem la hipòtesi que l'aorta SMF deu patir un procés accelerat d'envelliment a edat adulta mitjana. - Un biorreactor d'estirament mecànic per a examinar el contingut proteic de VSMCs d’aorta humana sana i SMF cultivades sota un ambient mecànic similar al real. Les cèl·lules SMF van mostrar una reacció alterada a l'administració de l'estirament, no relacionada amb el contingut ni distribució de marcadors fenotípics. Per tant, les VSMCs de SMF mostren una comunicació cèl·lula-matriu alterada no associada al fenotip. - Finalment, mitjançant la revisió sistemàtica de la literatura científica es va generar el proteoma de teixit aòrtic humà més complet de l’actualitat, dividit entre les bases de dades sana i aneurismàtica, que contenen 919 i 724 proteïnes diferents, respectivament. L'aplicació d'aquestes tecnologies ha proporcionat nous coneixements al camp de la biologia vascular, especialment pel que fa a la síndrome de Marfan.