Implication of lysosomes on glucose-dependent E2F1-driven cell growth control and their novel role in mitotic progression

Abstract

Lysosomes are the primary degradative organelles in mammalian cells. Indeed, lysosome enzymatic cocktail allows the degradation of a vast repertoire of cellular material through different converging pathways including macroautophagy. Lysosome function relies on both its acidification capacity, mediated by the vacuolar ATPase, and its cytosolic positioning, driven by the motor proteins kinesins and dyneins. Emerging evidences point out a relevant role of lysosomes in cancer progression denoting their important function in cellular homeostasis maintenance. Indeed, lysosomotropic drugs, such as chloroquine-derivatives, are already being used in clinical trials for cancer treatment. This PhD thesis aims to study lysosome functions in cancer cells to identify novel vulnerabilities related to this organelle. Two different questions are addressed herein: 1) The implication of lysosomes on glucose-mediated E2F1-driven mTORC1 activation and 2) The role of lysosomes in cell division.

E2F1 is overexpressed in numerous human cancers, including lung, breast and hepatocellular carcinomas. Traditionally, the major role reported for E2F1 in cancer is the activation of cell cycle. Previously, our group reported that E2F1 regulates cell growth, through the activation of mTORC1, a major regulator of protein synthesis and autophagy and demonstrated that E2F1 induces the anterograde movement of lysosomes, which is associated with translocation of mTOR to lysosomes and v-ATPase activation. Here we demonstrate that E2F1-dependent mTORC1 activation relies on glucose availability. E2F1 transcriptionally regulates several glycolytic enzymes, thus increasing glycolytic flux. More specifically, we described that E2F1 up-regulates the PFKFB3 isoenzyme of the PFK-2, a potent activator of glycolysis, and that PFKFB3 activity determines mTORC1 activation. We hypothesize that E2F1 is able to activate glycolysis and therefore increase v-ATPase and mTORC1 activity. Besides, E2F1 induces lysosome-dependent exocytosis which correlates with a metastatic phenotype. These novel functions of E2F1 in v-ATPase regulation and lysosomal trafficking provide insight into regulatory mechanisms by which E2F1 drives malignancy and highlight the potential role of lysosomes as a metabolic hub in mammalian cells.

Studies on lysosome function are mainly focused in cells in interphase. However, the implication of these organelles during cell division remains unclear. Mitosis is a key event during cell cycle, in which cells finally divide into two daughter cells. Mitotic progression comprises five active phases involving a dramatic rearrangement of cellular components in a short period of time. Until now, degradation of mitotic factors has been attributed only to ubiquitination and proteasome-dependent degradation. In the present study, we show that impairment of lysosomal trafficking and function delays mitotic progression and increases mitotic errors, phenomena accompanied by an increase in toroidal-shaped nuclei a reflection of impaired mitosis. Finally, we use a proteomic approach to discover novel lysosome protein substrates involved in mitotic progression. Interestingly, we identified regulatory proteins of the cohesin complex necessary for correct chromosomal segregation. By characterizing a novel function of lysosomes specifically in mitosis, our work establishes a novel model of regulation of cell division beyond the proteasome. In summary, this work provides new insights into the function of lysosomes down-stream of E2F1 oncogenic signaling, which modulates G1/S transition and cell proliferation but also into lysosomal function in the completion of cell cycle by regulating mitotic progression. Our work highlights the importance of targeting lysosomes for novel cancer therapies.

Els lisosomes són els principals orgànuls degradatius de la cèl·lula eucariota, capaços de degradar un ampli repertori de material cel·lular. La funció lisosomal depèn tant de la seva acidificació, sota el control de la v-ATPasa, com de la seva distribució citosòlica, regulada per kinesines i dineïnes. La funció lisosomal és essencial per preservar la homeòstasi cel·lular i la seva alteració està lligada al desenvolupament de malalties de diferent índole, des de trastorns neurodegeneratius fins al càncer. De fet, fàrmacs lisosomotròpics, tals com els derivats de la cloroquina, s’estudien actualment en assajos clínics com a tractament per un ampli ventall de tumors. L’objectiu d’aquesta tesi doctoral és l’estudi de les funcions lisosomals en cèl·lules canceroses per tal de definir noves vulnerabilitats relacionades a aquest orgànul. S’adrecen així doncs, dues preguntes experimentals: 1) La implicació dels lisosomes en l’activació de mTORC1 degut a E2F1 a través de la glucosa i 2) El rol dels lisosomes en la divisió cel·lular.

La funció oncogènica d’E2F1 s’ha atribuït tradicionalment al seu paper com a regulador del cicle cel·lular. Actualment, però, es coneix la seva implicació en diverses funcions relacionades amb la progressió tumoral, entre elles, el creixement cel·lular a través de l’activació de mTORC1. En aquest projecte, hem demostrat que l’activació d’mTORC1 és amplificada en presència de glucosa. E2F1 activa la transcripció d’enzims glucolítics, específicament l’isoenzim de la PFK-2 PFKFB3 i d’aquesta manera incrementa el flux glucolític. Hem descrit que l’activitat de PFKFB3 està directament relacionada amb l’activació d’mTORC1 suggerint la regulació del complex pel flux glucolític. En paral·lel, a través de la regulació del tràfic lisosomal, E2F1 incrementa la exocitosi lisosomal àmpliament correlacionada amb el fenotip metastàtic. Les funcions descrites aquí destaquen la importància del lisosoma en el mecanisme oncogènic d’E2F1 i recolzen la idea dels lisosomes com a plataformes d’integració del metabolisme cel·lular.

L’estudi de la funció lisosomal s’ha limitat majoritàriament a cèl·lules en interfase i pocs estudis es centren en la seva implicació en la divisió cel·lular (mitosi). La mitosi és un procés crucial en el cicle cel·lular en què la cèl·lula finalment es divideix en dues cèl·lules filles genèticament idèntiques. La progressió mitòtica requereix un ampli canvi morfològic, estrictament coordinat en un període de temps extremadament curt. En aquest context, la degradació de factors mitòtics és un element limitant per garantir la correcta progressió mitòtica. Fins ara, la degradació de factors mitòtics s’ha atribuït exclusivament al proteasoma deixant la funció lisosomal fora de l’escenari. En aquest estudi, demostrem que la inhibició de la funció lisosomal tant a nivell de tràfic com d’acidificació retarda la progressió mitòtica i incrementa la freqüència d’errors mitòtics, fenòmens acompanyats de l’aparició del nucli toroïdal el qual reflexa una mitosi aberrant. Finalment, hem usat una aproximació proteòmica per descobrir noves dianes lisosomals implicades en la mitosi. Entre aquestes, hem identificat proteïnes reguladores del complex de coesines, essencial pel correcte desenvolupament de la segregació cromosòmica. La caracterització de la funció lisosomal específicament en mitosi desenvolupada en aquest estudi implica un nou model de regulació de la divisió cel·lular més enllà de la degradació proteasomal. Aquest estudi dóna llum a la funció lisosomal sota el senyal oncogènic d’E2F1, un regulador clau de la transició G1/S del cicle cel·lular així com demostra la implicació dels lisosomes per la culminació del cicle a través de la regulació de la mitosi. En conclusió, el nostre treball recolza la importància del lisosoma com a possible diana terapèutica en el càncer.