Neuroprotección mediante terapia combinada (Hipotermia+Alopurinol) en un modelo animal de daño cerebral hipóxico-isquémico

Abstract

INTRODUCCIÓN: La encefalopatía hipóxico-isquémica (EHI) es una de les causas más importantes de daño cerebral neonatal. La hipotermia terapéutica (HT) es el tratamiento establecido en la actualidad para los neonatos a término, afectos de una EHI. A pesar de ello, la HT no consigue una tratamiento neuroprotector completo. El alopurinol ha demostrado ser en diversos estudios animales un buen fármaco neuroprotector, pero nunca ha sido evaluado conjuntamente con la HT. En los últimos años los hallazgos clínicos han demostrado que los niños de sexo masculino afectos de EHI presentan peores resultados cuando se comparan con las de sexo femenino en resultados cognitivos. A pesar de ello, hay poco estudios que hayan evaluado el efecto de las terapias neuroprotectoras teniendo en cuenta el género en los resultados. El objetivo del presente estudio es evaluar el efecto aditivo potencial neuroprotector del alopurinol cuando se administra conjuntamente con la HT en un modelo roedor de EHI moderada. Las diferencias neuroprotectoras respecto el género fueron también evaluadas.

MÉTODOS: Crías de rata de sexo masculine y sexo femenino de 10 días de vida (P10) fueron sometidas a un evento HI (modelo Rice-Vannucci) y randomizadas en cinco grupos: intervención shame (control), no tratamiento (HI), hipotermia (HIH), alopurinol (HIA) y tratamiento dual (hipotermia y alopurinol) (HIHA). Para evaluar la eficacia neuroprotectora, 24 horas después del evento HI los niveles de caspasa3 fueron medidos. El área dañada del hipocampo y del cerebro fue medida a las 72 horas del evento HI. El test geotaxis negativo fue realizado para evaluar los reflejos precoces motores. El aprendizaje de memoria temporo-espacial fue medido a través del Laberinto Acuático de Morris (LAM) a los 25 días de vida.

RESULTADOS: El área cerebral dañada y el volumen preservado del hipocampo fue diferente entre los grupos ( p=0.001). La lesión de mayor tamaño fue observada en el grupo HI, seguido por el HIA. No se objetivaron diferencias entre grupo control, HIH y HIHA. Cuando el proceso de aprendizaje fue analizado, no se objetivaron diferencias. Las hembras del grupo HIA presentaron resultados similares a los del grupo HIH y HIHA. Al analizar los resultados de la caspasa3 se objetivó incrementada en ambos grupos HI y HIA. A pesar de ello, los niveles de caspasa3 en hembras sólo se encontraba elevada en el grupo HI. Todos los animales tratados presentaron una mejoría en los test funcionales tanto en los resultados a corto (test geotaxis negativo) como a largo plazo (LAM). A pesar de ellos, las hembras tratadas presentaron mejores resultados. En los resultados a corto plazo no se objetivaron diferencias de sexo.

CONCLUSIONES: Nuestros resultados sugieren que la terapia dual confieren a una gran neuroprotección después de un evento HI. Hubo mejorías a nivel functional, histológico y molecular en todos los grupos tratados. Estas diferencias fueron más importantes en las hembras que en los machos. No se objetivaron diferencias estadísticamente significativas entre los grupos HIH y HIHA, ambos presentaron una gran mejoría. Nuestros resultados confirman la idea de diferentes mecanismos y vías de muerte celular, dependiendo del sexo.

BACKGROUND: Hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE) is one of the most important causes of neonatal brain injury. Therapeutic hypothermia (TH) is the standard treatment for term newborns after perinatal hypoxic ischemic injury (HI). Despite this, TH does not provide complete neuroprotection. Allopurinol seems to be a good neuroprotector in several animal studies, but it has never been tested in combination with hypothermia. Clinical findings show that male infants with (HI) fare more poorly than matched females in cognitive outcomes. However, there are few studies about neuroprotection taking gender into account in the results. The aim of the present study was to evaluate the potential additive neuroprotective effect of allopurinol when administrated in association with TH in a rodent model of moderate HI. Gender differences in neuroprotection were also evaluated.

METHODS: P10 male and female rat pups were subjected to HI (Vannucci model) and randomized into five groups: sham intervention (Control), no treatment (HI), hypothermia (HIH), allopurinol (HIA), and dual therapy (hypothermia and allopurinol) (HIHA). To evaluate a treatment's neuroprotective efficiency, 24 hours after the HI event caspase3 activation was measured. Damaged area and hippocampal volume were also measured 72 hours after the HI event. Negative geotaxis test was performed to evaluate early neurobehavioral reflexes. Learning and spatial memory were assessed via Morris Water Maze (MWM) test at 25 days of life.

RESULTS: Damaged area and hippocampal volume were different among treatment groups (p = 0.001). The largest tissue lesion was observed in the HI group, followed by HIA. There were no differences between control, HIH, and HIHA. When learning process was analyzed, no differences were found. Females from the HIA group had similar results to the HIH and HIHA groups. Cleaved caspase 3 expression was increased in both HI and HIA. Despite this, in females cleaved caspase-3 was only differently increased in the HI group. All treated animals present an improvement in short-term (Negative geotaxis) and long-term (WMT) functional tests. Despite this, treated females present better long-term outcome. In short-term outcome no sex differences were observed.

CONCLUSIONS: Our results suggest that dual therapy confers great neuroprotection after an HI event. There were functional, histological, and molecular improvements in all treated groups. These differences were more important in females than in males. No statistically significant differences were found between HIHA and HIH; both of them present a great improvement. Our results support the idea of different regulation mechanisms and pathways of cell death, depending on gender