Vigilancia ambiental de Compuestos Disruptores Endocrinos y otros contaminantes prioritarios en el medio acuático mediante técnicas cromatográficas y biológicas

Abstract

Los compuestos disruptores endocrinos (EDCs) son sustancias exógenas capaces de alterar las funciones del sistema endocrino y la regulación del desarrollo embrionario, y por consecuencia, con capacidad de provocar efectos adversos sobre la salud de un organismo o su progenie (WHO, 2012). Hay un aumento de preocupación no solo por la presencia de estos compuestos en el medio ambiente, sino por los efectos biológicos que pueden ejercer sobre la salud humana y de animales.

Los EDCs pueden ser compuestos naturales y sintéticos Tienen diversos mecanismos de actuación y presentan características propias, de forma que cada EDC tiene una curva Dosis-Respuesta No Monotónica (NMDR) característica, pueden ejercer mayores efectos estrogénicos a dosis muy bajas (low dose), el momento de la exposición a los EDCs es crítico, siendo mayor e irreversible en la fase prenatal, tienen largos periodos de latencia. En los últimos 10 años ha habido muchos avances en su conocimiento y se han relacionado enfermedades tan comunes como la diabetes y la obesidad y hay estudios sobre sus efectos, que pueden manifestarse a lo largo de varias generaciones a través de la epigenética.

Son compuestos que entran en el medio acuático principalmente por las descargas de las estaciones depuradoras de aguas residuales y pueden distribuirse en distintos compartimentos, siendo adsorbidos en fangos, sedimentos y material particulado. Las mezclas de EDCs a las que estamos expuestos en el medioambiente pueden presentar efectos sinérgicos, antagónicos, inhibitorios o aditivos. Presentan actividad estrogénica a concentraciones muy bajas (los estrógenos a 1-10 ng/L y los alquilfenoles a g/L).

La gran variedad de propiedades físico-químicas de los EDCs y las bajas concentraciones a las que están presentes en el medioambiente, hace que su determinación represente un reto por su complejidad, por lo que se necesita métodos químicos muliresiduo sensibles, así como técnicas biológicas que permitan determinar la actividad estrogénica que presentan a concentraciones muy bajas.

Por tanto, ante la actual problemática de la contaminación del agua por compuestos disruptores endocrinos, y la creciente preocupación por los efectos biológicos que pueden tener sobre la salud y el medioambiente, esta tesis responde a la demanda de métodos analíticos para su determinación y control, y a la necesidad de establecer metodologías integradas con técnicas biológicas para la determinación no solo de las bajas concentraciones a las que los EDCs están presentes en el medioambiente acuático, sino también de su actividad estrogénica.

Con este objetivo, en esta tesis se ha llevado a cabo la optimización de una metodologías integrada, de cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas para identificar los EDCs en el medio acuático, con análisis confirmatorio de estrógenos mediante LC-MS(MS) y el bioensayo con levaduras recombinantes (RYA) que determina de forma cuantitativa la estrogenicidad total de la muestra, detectando tanto los estrógenos naturales como los xenoestrógenos sin tener en cuenta la identidad de los compuestos químicos responsables de este efecto. Adicionalmente, Se han validado inmunoensayos ELISA para la determinación de compuestos

alquilfenólicos en aguas, que permiten realizar un previo screening y analizar un gran número de muestras en menor tiempo y a coste inferior en Programas de Vigilancia Ambiental (PVA)

Se han llevado a cabo PVAs en Portugal y en las cuencas de los ríos Llobregat y Ter en Cataluña (Nordeste de España). La actividad estrogénica ha sido atribuida principalmente a los compuesto alquilfenólicos, más ubicuos, mientras que en los puntos en los que se han identificado y confirmado estrógenos mediante LC- MS/MS, éstos compuestos tienen mayor contribución a la estrogenicidad total.

Los resultados obtenidos ponen de manifiesto la importancia de analizar la fracción particulada en aguas para determinar la concentración total de compuestos alquilfenólicos, debido a la distribución de los compuestos más estrogénicos (nonilfenol y octilfenol) en el material particulado y la absorción en los fangos.

El bioensayo RYA ha detectado una baja actividad estrogénica en las aguas superficiales, mientras que el análisis del PM en aguas residuales ha permitido obtener una mayor eliminación de la estrogenicidad (95- 97%), más importante medioambientalmente las concentraciones químicas por los potenciales efectos que puede producir en la fauna y los seres humanos.

Finalmente, el desarrollo de técnicas más avanzadas para la determinación de EDCs, el aumento de publicaciones científicas, y el hecho de que los principales EDCs estudiados en esta tesis (NP, BPA, DEHP, E1, E2, E3) han sido posteriormente incluidos en la normativa europea y de USA de contaminantes prioritarios (D. 2008/105/EC, D. (UE) 2015/495/EC, Reglamento REACH y D. (UE) 2003/53/EC), ponen de manifiesto la relevancia de los compuestos estudiados.

There is growing evidence that some compounds, known as endocrine-disrupting compounds (EDCs), can mimic or antagonize the actions of steroid hormones, affecting the health of humans and wildlife species by disrupting their normal endocrine function.

EDCs are natural and synthetic compounds that can be found in the aquatic environment as a result of the chemical industry, pharmacy and household applications. We are exposed to mixtures of EDCs that can exert physiological effects, synergic, antagonist o additive, at very low concentrations (i.e. -estradiol and ethinylestradiol are reported to be estrogenic to fish at levels as low as 0.1 to 10 ng/L).

Over the past decade there have been significant advances in our understanding of EDCs, their mechanisms of action and biological effects on human and wildlife health, suggesting a greater role for EDCs in disease than what was predicted. EDCs have Non-Monotonic Dose Response corves, they can exert effects at lower doses than expected, the moment of the exposure is critical, their effects can have latency periods and even pass to other generations. To control the endocrine disruptors, there is a need for monitoring large numbers of samples and for methodologies, not only to identify the EDCs at the low dose that they are present in the environment, but also to assess their estrogenic activity.

This thesis responds to increasing concerns on this matter, providing an integrated methodology that combine analytical methods by LC-MS(MS) to determine the presence of EDCs at low concentrations in the environment, as well as biological techniques (Recombinant Yeast Assay, RYA) to assess their estrogenic activity in environmental samples. In addition, ELISA immunoassays have been validated as a screening tool for a rapid and cost-effective detection of alkylphenolic compounds in water samples in monitoring programs.

Monitoring programs were performed in Portugal and the Llobregat and Ter River basins in Catalonia, Spain. Estrogenic activity was mainly attributed to alkylphenolic compounds, whereas in a few samples, the estrogens identified and confirmed by LC-MS/MS were responsible for the estrogenicity. The obtained results pointed out the importance to analyze the particulated fraction of waters to determine the total concentration of alkylphenolic compounds, due to partitioning of the most estrogenic (nonylphenol and octylphenol) upon particulate matter (PM) and enrichment in sludge. RYA showed weak estrogenic activity in surface water samples, whereas the analysis of PM in wastewaters permitted to obtain higher removal of estrogenicity (95-97%) than chemical concentrations, more important from the environmental point of view. Finally, due to their estrogenic properties, some of the EDCs studied in this thesis (i.e. Nonylphenol, DEHP, estradiol, ethinylestradiol) have been included in the European regulation (D. 2000/60/EC, D. 2008/105/EC, D. 2015/495/EC, REACH Regulation and D. 2003/53/EC) and in the US EPA priority list, confirming the relevance of the target compounds selected.