Conexión entre metabolismo del peptidoglicano, resistencia a beta-lactámicos y virulencia en Pseudomonas aeruginosa

Abstract

[cat] Pseudomonas aeruginosa és un patogen oportunista amb una gran importància clínica, destacant per la seva enorme capacitat per desenvolupar resistències als antimicrobians, entre elles als β-lactàmics. El seu principal mecanisme de resistència a aquests antibiòtics consisteix en la producció de la β-lactamasa cromosòmica induïble AmpC, la regulació de la qual està íntimament relacionada amb el remodelat/reciclatge del peptidoglicà (PGN), la qual cosa també sembla estar connectada amb l'eficàcia biològica i la virulència, tal com suggereix la bibliografia existent. - Contingut de la investigació: Atès l'exposat, l'objectiu general d'aquesta tesi va ser analitzar les connexions entre la regulació de l'expressió d'ampC, el reciclatge del PGN, el fitness i la virulència de P. aeruginosa. Més concretament, investigar l'impacte sobre el fitness i la virulència ocasionat per la hiperproducció d'AmpC mediada per dues vies: i) inactivació de les amidases AmpD, AmpDh2 i AmpDh3 de la ruta de reciclatge del PGN (comportant, a més de la total desrepresió d'ampC i la resistència extrema derivada, i de l'alteració del reciclatge del PGN, un elevat cost biològic); ii) PBP4 (proteïna fixadora de penicil·lina no essencial)/sistema CreBC (sistema regulador de dos components, causant d'una resposta metabòlica general, que sembla incrementar el rendiment de la hiperproducció d'AmpC en termes fenotípics). Per a dur a terme aquest objectiu, es va realitzar una caracterització fenotípica i l'anàlisi de diversos paràmetres i gens relacionats amb el fitness i la virulència de dues soques de P. aeruginosa (PAO1 i PA14) en una àmplia bateria de mutants knockout (simples i/o combinats) a diferents gens clau en la regulació d'ampC i el reciclatge del PGN. - Conclusió: Els resultats així obtinguts van indicar que les soques PAO1 i PA14 presenten una dinàmica de hiperproducció d'AmpC similar, amb increments en l'expressió d'ampC d'unes 1 000 vegades en els respectius triples mutants en amidases, encara que amb algunes lleugeres diferències. També es va constatar que la triple inactivació de les amidases va tenir diverses conseqüències fenotípiques en ambdues soques: i) desrepresió total d'ampC; ii) pèrdua de fitness, augmentant el temps de duplicació en la fase exponencial de creixement; iii) reducció de les motilitats bacterianes (twitching, swimming i swarming); iv) pèrdua gairebé total de citotoxicitat sobre cultiu cel·lular, independentment de la manca de motilitat; i v) descens de la virulència en model invertebrat. No obstant això, la triple inactivació de les amidases no va afectar a altres paràmetres: invasivitat cel·lular, capacitat inflamatòria sobre cultiu cel·lular, susceptibilitat al sèrum i a neutròfils, i estructura de la paret cel·lular. Els paràmetres afectats per la triple inactivació d'amidases van revertir a nivells equiparables a la soca salvatge tant per la complementació amb el gen ampD clonat al plàsmid pUCPAD com per la inactivació d'ampC, indicant que la pèrdua d'amidases en si mateixa no és la causant dels efectes observats. A més, altres mutants hiperproductors d'AmpC d'igual nivell (com el doble mutant de PAO1 dacB-ampD i PAO1 hiperexpresant el gen ampC codificat al plàsmid pUCPAC multicòpia) no van mostrar una pèrdua de fitness, demostrant que el possible cost energètic associat a la hiperproducció d'AmpC no és l'únic responsable del fenotip atenuat. D'altra banda, l'alteració del reciclatge del PGN tampoc és la causant per si mateixa d'aquest fenotip, ja que el mutant ampG de PAO1 (amb el pas al citoplasma de fragments del PGN periplàsmics bloquejat) va presentar un fenotip similar a la soca salvatge. Per contra, la hiperexpressió d'ampC (codificat a pUCPAC) al mutant ampG si va causar un fenotip atenuat, idèntic al del triple mutant en amidases, del que es dedueix que tant l'alteració del reciclatge del PGN com la hiperproducció d'AmpC són les dues condicions necessàries, però no suficients per si soles, per a l'aparició del fenotip atenuat. A això caldria sumar la probable influència de l'augment dels temps de duplicació associats a aquest. L'esmentada pèrdua de virulència es va veure lligada a un descens a l'expressió de gens clau per a la virulència (com els codificants per als components del pili tipus IV i del sistema de secreció tipus III); afectant aquesta reducció comparativament més a PA14 que a PAO1, en basar la primera la seva virulència principalment en un alt nivell de citotoxicitat. També es va comprovar que el fitness inalterat del mutant dacB no es deu a una compensació mediada pel sistema regulador CreBC, com s'havia suggerit fins ara, ja que en inactivar-se va mantenir el fenotip salvatge. Tampoc es van observar diferències a l'expressió d'ampR (considerat un regulador global) en els mutants analitzats. Per tant, tot això sembla indicar que tot i que ser CreBC i AmpR reguladors globals, no es tracta dels responsables dels resultats obtinguts.

[spa] - Introducción: Pseudomonas aeruginosa es un patógeno oportunista con una gran importancia clínica, destacando por su enorme capacidad para desarrollar resistencias a los antimicrobianos, entre ellos a los β-lactámicos. Su principal mecanismo de resistencia a dichos antibióticos consiste en la producción de la β-lactamasa cromosómica inducible AmpC, cuya regulación está íntimamente relacionada con el remodelado/reciclado del peptidoglicano (PGN), lo cual también parece estar conectado con la eficacia biológica y la virulencia, tal como sugiere la bibliografía existente. - Contenido de la investigación: Considerando lo expuesto, el objetivo general de esta tesis fue analizar las conexiones entre la regulación de la expresión de ampC, el reciclado del PGN, el fitness y la virulencia de P. aeruginosa. Más concretamente, investigar el impacto sobre el fitness y la virulencia ocasionado por la hiperproducción de AmpC mediada por dos vías: i) inactivación de las amidasas AmpD, AmpDh2 y AmpDh3 de la ruta de reciclado del PGN (conllevando, además de la total desrepresión de ampC y la resistencia extrema derivada, y de la alteración del reciclado del PGN, un elevado coste biológico); ii) PBP4 (proteína fijadora de penicilina no esencial)/sistema CreBC (sistema regulador de dos componentes, causante de una respuesta metabólica más general que parece incrementar el rendimiento de la hiperproducción de AmpC en términos fenotípicos). Para ello se realizó una caracterización fenotípica y el análisis de diversos parámetros y genes relacionados con el fitness y virulencia de dos cepas de P. aeruginosa (PAO1 y PA14) en una amplia batería de mutantes knockout (simples y/o múltiples) en diferentes genes clave en la regulación de ampC y reciclado del PGN. - Conclusión: Los resultados así obtenidos indicaron que las cepas PAO1 y PA14 presentan una dinámica de hiperproducción de AmpC similar, con incrementos en la expresión de ampC de unas 1 000 veces en los respectivos triples mutantes en amidasas, aunque con algunas ligeras diferencias. También se constató que la triple inactivación de las amidasas tuvo varias consecuencias fenotípicas en ambas cepas: i) desrepresión total de ampC; ii) pérdida de fitness, aumentando el tiempo de duplicación en la fase exponencial de crecimiento; iii) reducción de las motilidades bacterianas (twitching, swimming y swarming); iv) pérdida casi total de citotoxicidad sobre cultivo celular, independientemente de la carencia de motilidad; y v) descenso de la virulencia en modelo invertebrado. Sin embargo, la triple inactivación de amidasas no afectó a otros parámetros: invasividad celular, capacidad inflamatoria sobre cultivo celular, susceptibilidad al suero y a neutrófilos, y estructura de la pared celular. Los parámetros afectados por la triple inactivación de amidasas revirtieron a niveles equiparables a la cepa salvaje tanto por la complementación con el gen ampD (clonado en el plásmido pUCPAD) como por la inactivación de ampC, indicando que la pérdida de amidasas en sí misma no es la causante de los efectos observados. Además, otros mutantes hiperproductores de AmpC de igual nivel (como el doble mutante de PAO1 dacB-ampD y PAO1 hiperexpresando el gen ampC codificado en el plásmido multicopia pUCPAC) no mostraron pérdida de fitness, demostrando que el posible coste energético asociado a la hiperproducción de AmpC no es el único responsable del fenotipo atenuado. Por otro lado, la alteración del reciclado del PGN tampoco es la causante por sí misma de dicho fenotipo, ya que el mutante ampG de PAO1 (con el paso al citoplasma de fragmentos periplásmicos del PGN bloqueado) presentó un fenotipo similar a la cepa salvaje. Por el contrario, la hiperexpresión de ampC (codificado en pUCPAC) en el mutante ampG sí causó un fenotipo atenuado, idéntico al del triple mutante en amidasas, de lo que se deduce que tanto la alteración del reciclado del PGN como la hiperproducción de AmpC son las dos condiciones necesarias, pero no suficientes por sí solas, para la aparición del fenotipo atenuado. A ello habría que sumar la probable influencia del aumento del tiempo de duplicación asociado al mismo. La citada pérdida de virulencia se vio ligada a un descenso en la expresión de genes clave para la virulencia (tales como los codificantes para los componentes del pili tipo IV y del sistema de secreción tipo III); afectando dicha reducción comparativamente más a PA14 que a PAO1, al basar la primera su virulencia principalmente en un alto nivel de citotoxicidad. También se comprobó que el fitness inalterado del mutante dacB no se debe a una compensación mediada por el sistema regulador CreBC, como se había sugerido hasta ahora, puesto que al inactivarlo se mantuvo el fenotipo salvaje. Tampoco se observaron diferencias en la expresión de ampR (considerado un regulador global) en los mutantes analizados. Por tanto, todo ello parece indicar que a pesar de ser CreBC y AmpR reguladores globales, no se trata de los responsables de los resultados obtenidos.

[eng] - Introduction: Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic pathogen with a mayor clinical importance, standing out for its enormous capacity to develop resistances to the antimicrobials, among them to β-lactam antibiotics. Its main mechanism of resistance to these antibiotics consists in the production of the chromosomal inducible β-lactamase AmpC, whose regulation is closely related to the remodeling/recycling of the peptidoglycan (PGN), which also seems to be connected with the biological efficacy and the virulence, as suggested in the existing bibliography. - Research content: The general objective of this thesis was to analyse the connections between the regulation of the expression of ampC, the recycling of PGN, fitness and virulence of P. aeruginosa. More specifically, to investigate the impact on fitness and virulence caused by the overproduction of AmpC mediated by two ways: i) inactivation of the AmpD, AmpDh2 and AmpDh3 amidases of the PGN recycling path (entails, in addition to the total derepression of ampC and the extreme derived resistance, and of the impairment of the PGN recycling, a high biological cost); ii) PBP4 (non-essential penicillin-binding protein)/CreBC system (two-component regulatory system, which causes a more general metabolic response, which seems to increase the performance of AmpC hyperproduction in phenotypic terms). To achieve this objective, a phenotypic characterization was carried out, as well as the analysis of several parameters and genes related to the fitness and virulence of two strains of P. aeruginosa (PAO1 and PA14) in a large battery of knockout mutants (single and/or combined) in different key genes in ampC regulation and PGN recycling. - Conclusion: The obtained results indicated that the PAO1 and PA14 strains show a similar AmpC hyperproduction dynamics, with increases in the ampC expression of about 1 000 times in the respective triple mutants in amidases, although with some slight differences. It was also found that the triple inactivation of amidases had several phenotypic consequences in both strains: i) total derepression of ampC; ii) loss of fitness, increasing the doubling time in the exponential phase of growth; iii) reduction of bacterial motilities (twitching, swimming and swarming); iv) almost total loss of cytotoxicity on cell culture, independently of the motility impairment; and v) decrease in virulence in invertebrate model. However, the triple inactivation of amidases did not affect other parameters: cellular invasiveness, capacity of inflammation on cell culture, susceptibility to serum and neutrophils, and cell wall structure. The parameters affected by the triple inactivation of amidases reverted to levels comparable to the wild strain both by the complementation with the ampD gene cloned in the plasmid pUCPAD and by the inactivation of ampC, indicating that the loss of amidases by itself is not the cause of the observed effects. In addition, other AmpC-hyperproducing mutants of the same level (such as the double mutant of PAO1 dacB-ampD and PAO1 hyperexpressing the ampC gene encoded in the multicopy plasmid pUCPAC) did not show a loss of fitness, demonstrating that the possible energy cost associated with the AmpC hyperproduction is not the only responsible for the attenuated phenotype. On the other hand, the impariment of the PGN recycling is not the cause of the phenotype either, since the mutant ampG of PAO1 (with the door to the cytoplasm of the periplasmic PGN fragments blocked) showed a phenotype similar to the wild type strain. In contrast, the hyperexpression of ampC (encoded in pUCPAC) in the mutant ampG did cause an attenuated phenotype, identical to the triple mutant in amidases, from which it is deduced that both the affectation of the PGN recycling and the overproduction of AmpC are the two necessary conditions, but not enough by themselves, for the obtention of the attenuated phenotype. To this should be added the probable influence of the increase of the duplication time associated with it. The aforementioned loss of virulence was linked to a decrease in the expression of key genes for virulence (such as those coding for pili type IV components and the type III secretion system); affecting this reduction comparatively more to PA14 than to PAO1, since the first relies its virulence mainly on a high level of cytotoxicity. It was also found that the unaltered fitness of the dacB mutant is not due to compensation mediated by the CreBC regulatory system, as had been suggested up to now, since the wildtype phenotype was maintained after its inactivation. No differences were observed in the expression of ampR (considered a global regulator) in the mutants analysed. Therefore, all this seems to indicate that despite being CreBC and AmpR global regulators, they are not responsible for the results obtained.