Bases moleculars i estratègies terapèutiques contra les metàstasis del melanoma uveal

Abstract

El melanoma uveal (UM) és el tumor intraocular més freqüent en adults. La cirurgia i la braquiteràpia han millorat les taxes de supervivència, però fins al 40% dels pacients desenvolupen metàstasis hepàtiques que són refractàries a les teràpies convencionals i causen la mort dels pacients. Així doncs, combatre el procés de metàstasi del càncer és imprescindible per obtenir un tractament eficaç que augmenti la supervivència global dels pacients. Recentment, s'ha proposat que els tumors contenen una subpoblació de cèl·lules amb un comportament similar a cèl·lules mare i una major resistència als fàrmacs, les quals són responsables de les metàstasis. És per això que per trobar noves dianes i ajustar les dosis terapèutiques recomanades, vam realitzar els nostres estudis farmacològics in vitro utilitzant tant les poblacions resistents a la mort cel·lular per anoikis com les cèl·lules no seleccionades de línies cel·lulars de melanoma uveal humà. Aquestes tenien morfologies diferents, eren derivades tant de metàstasis com del tumor primari, i presentaven mutacions en els oncogens GNAQ o GNA11. En primer lloc, vam veure que les poblacions resistents a l’anoikis eren capaces de créixer en condicions no adherents, com a esferoides i “melanosferes”, i mostraven característiques associades amb cèl·lules pluripotencials. També mostraven una major resistència a la quimioteràpia i expressaven marcadors propis de cèl·lules mare, com ara CD133, CD44, CD15 i els factors de transcripció OCT-4, SOX-2, NANOG i MITF, en comparació amb la població global que creixia en condicions 2D. A més, aquest fenotip característic de les cèl·lules mare tumorals revertia després de 5-6 divisions en condicions adherents de cultiu in vitro. Paral·lelament, vam observar que el tractament in vitro amb TGF-β de les cèl·lules cultivades en 2D desencadenava una regulació ascendent dels gens relacionats amb la pluripotència cel·lular i els factors de transcripció reguladors de la transició epiteli-mesènquima (EMT), SNAI1, SNAI2, TWIST1 i ZEB1, aconseguint nivells d'expressió similars als de les “melanosferes”. Significativament, només aquelles cèl·lules provinents de les “melanosferes” van mostrar la capacitat de migrar cap a un medi condicionat per fibroblasts que contenia IGF-1. Aquesta capacitat de migració, es va veure bloquejada a través de l’anticòs IMC-A12, contra el IGFR-1β. D'acord amb aquests resultats, vam determinar que les cèl·lules de les “melanosferes” sobreexpressaven el receptor IGFR-1β alhora que secretaven MMP-2 al medi extracel·luar. Els efectes antiproliferatius de diversos inhibidors de proteïna quinases sobre aquestes cèl·lules es van analitzar a través de la biblioteca d’inhibidors de quinases Screen-Well® (BML-2832-0100). En aquest sentit, vam seleccionar els inhibidors de MEK i IGFR-1β com a millors candidats per combatre les cèl·lules

més agressives del melanoma uveal amb característiques de cèl·lules mare i un fenotip altament migratori. Finalment, resultats preliminars van indicar que la línia cel·lular OMM-2.5, derivada d’una metàstasi de melanoma uveal, produïa el major nombre de vesícules extracel·lulars in vitro. Aquestes vesícules, eren majoritàriament exosomes, transportaven biomarcadors, integrines i ARN exosomals com a càrrega, i podien ser captades pels hepatòcits.

Uveal Melanoma (UM) is the most common intraocular tumour in adults. Surgery and brachytherapy have improved survival rates, but up to 40% of patients develop liver metastases that are refractory to conventional therapies and cause patients’ death. Thus, targeting cancer metastasis is imperative for effective treatment to increase patients’ overall survival. It has been proposed that tumours may contain a subpopulation of cells with stem cell-like behaviour and increased drug resistance, which are the seeds of metastases. To find new targets and refine appropriate therapeutic doses we performed our in vitro drug-screeening studies using both, anoikis-resistant populations and unselected cells from human uveal melanoma cell lines. These had different morphologies, metastatic or primary origin, and GNAQ or GNA11 mutations. First, we found that anoikis-resistant populations were able to grow in non- adherent conditions as multicellular spheroids and melanospheres which displayed traits associated with stemness. They showed increased chemoresistance and expression of stem-cell markers such as CD133, CD44, CD15, and the transcription factors OCT-4, SOX-2, NANOG and MITF, as compared to the global population growing in 2D conditions. Moreover, this stemness-like phenotype could be switched back after 5-6 passages under attached conditions. Furthermore, treatment of 2D cultures with TGF-β triggered an up-regulation of the stemness-related genes and transcription factors SNAI1, SNAI2, TWIST1 and ZEB1 among other EMT-related genes, reaching similar expression levels to those from melanospheres. Remarkably, only cells from melanospheres were able to migrate towards a conditioned-media from fibroblast containing IGF-1. This transwell-migration ability was impaired by IMC-A12 antibody against IGFR- 1β. In accordance with these results, cells from melanospheres overexpressed receptor IGFR-1β. In addition, these cells also produced MMP-2. The antiproliferative effects of protein kinase inhibitors were stated using the Screen-Well® Kinase Inhibitor Library (BML-2832-0100). In this regard, we favor the MEK and IGFR-1β inhibitors to fight aggressive uveal melanoma cells with a stemness and migratory phenotype. Finally, preliminary results indicated that OMM-2.5 cell line, derived from metastasis, produced the largest number of extracellular vesicles. These vesicles were mostly exosomes, were uptaken by hepatocytes and carried exosomal biomarkers, integrins and RNAs as cargo.