Avaluació dels efectes lipidòmics i fenotípics d’estressants ambientals sobre cultius cel·lulars mitjançant mètodes bioanalítics i quimiomètrics

Abstract

Les ciències òmiques proporcionen una visió holística de la fisiologia cel·lular i del funcionament dels sistemes biològics i estan presents en tots els camps d’estudi de la biologia molecular. La lipidòmica és una subdisciplina de la metabolòmica, la qual a la seva vegada és una de les branques principals de l’òmica. En el camp ambiental, els estudis òmics tenen la finalitat d’avaluar les alteracions que els organismes poden patir com a conseqüència de l’exposició a diferents factors presents en el medi, com poden ser els compostos químics contaminants (per exemple els pesticides), i que en el seu conjunt donen lloc al que avui en dia s’anomena l’exposòmica. Els estudis lipidòmics duts a terme en aquesta Tesi s’han realitzat seguint una anàlisi no dirigida emprant la cromatografia de líquids acoblada a l’espectrometria de masses (LC-MS). Aquesta és una de les tècniques analítiques més potents que ha estat àmpliament emprada gràcies a la seva capacitat d’anàlisi dels metabòlits i lípids dels diversos sistemes biològics. L’aproximació òmica no dirigida porta associada l’anàlisi multivariant de dades, donat el gran volum de dades que s’acostumen a generar. En aquests estudis és necessària la compressió de les dades sense pèrdua d’informació espectral i resolució, i una identificació simultània de l’elevat nombre de compostos químics presents en les mostres. Per tot això, els conjunts de dades LC-MS necessiten ser processats adequadament a partir de mètodes d’anàlisi multivariant de dades i de mètodes quimiomètrics. En aquest sentit, s’ha realitzat la validació d’una nova metodologia pel tractament de dades de LC-MS d’estudis òmics no dirigits. Aquesta nova metodologia es denomina ROIMCR i està basada en l’acoblament d’un mètode de compressió i filtració de les dades, sense pèrdua de resolució espectral, com és el mètode de selecció de les Regions d’interès (ROI), amb el mètode de resolució multivariant de corbes per mínims quadrats alternats (MCR-ALS). A partir de l’anàlisi d’una mescla sintètica de diferents lípids i de mostres de cultius cel·lulars que els contenien es va realitzar la validació del mètode ROIMCR, prèviament desenvolupat en el nostre grup d’investigació.

En aquesta Tesi a més, s’han estudiat els efectes de diferents estressants ambientals sobre diversos models cel·lulars. En un primer bloc es van determinar els efectes de tres disruptors endocrins (Aroclor 1254, Clorpirifòs i Aldrin) en el fenotip i el lipidoma de les cèl·lules de càncer de pròstata DU145. Es va comprovar que l’exposició cel·lular a l’Aroclor i el Clorpirifòs indueix un fenotip maligne amb mecanismes similars en ambdós casos. Aquests resultats van ser diferents als observats en les cèl·lules exposades a Aldrin, que presentaven un fenotip de transició epitelial mesenquimal (EMT. Posteriorment, es va aprofundir en l’estudi lipidòmic de la inducció de la EMT en les cèl·lules DU145 mitjançant la citoquina TNFα. En l’estudi lipidòmic no dirigit de la inducció de EMT es va poder detectar i confirmar un increment significatiu de triacilglicèrids (TAGs), que també s’havia detectat en l’exposició crònica als diferents disruptors endocrins estudiats. En l’altre bloc d’exposòmica d’aquesta Tesi, s’ha realitzat l’estudi lipidòmic no dirigit dels efectes de la radiació solar UV de forma aguda i crònica en els melanòcits i queratinòcits primaris humans. Aquest tipus de cèl·lules es troba present en l’epidermis, una de les capes de la pell humana que té com a funció principal protegir el cos humà de les agressions ambientals externes, entre els quals destaca la radiació solar. Ambdós models cel·lulars de l’epidermis varen presentar patrons fenotípics i una composició de lípids diferents a la irradiació UV, ja que cadascun adopta una estratègia diferent de supervivència. En el cas dels melanòcits, els canvis s’aprecien en les irradiacions agudes, donant lloc a pseudòpodes. Per contra, amb el pas de les irradiacions (irradiació crònica) tendeixen a adquirir els valors de les mostres control. D’altra banda, els queratinòcits presenten les modificacions de forma més progressiva, fent-se més significatives amb l’augment del nombre d’irradiacions UV, mostrant la inducció de la diferenciació cel·lular cap a corneòcits. En conjunt, aquesta Tesi pretén aportar i contribuir al desenvolupament de les eines de recerca de la lipidòmica analítica no dirigida en estudis exposòmics on s’avaluen els efectes produïts pels estressants ambientals sobre cultius cel·lulars, com a organisme biològic model.

Omics sciences refer to the collective technologies used to deeply characterize different types of molecules (nucleic acids, proteins, metabolites) present in the cells of organisms. Omics analysis are often conducted using high-throughput technologies that produce huge amounts of data, which need for chemometric analysis methods to extract information about the relevant molecules in the cells under specific conditions. In this Thesis, liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS) analysis and different chemometric methodologies are applied to perform untargeted lipidomic analysis of cell cultures under specific environmental stresses. In the first section of results, the validation of a recently proposed procedure for LC-MS data compression and processing is presented, using as example the analysis of lipid mixture. This method consists of a preliminary selection of the Regions of Interest of the LC-MS data (MSROI) coupled to their throughout chemometric analysis by the Multivariate curve resolution alternating least squares method (MCR-ALS). In the following chapters, different untargeted lipidomic studies of cell cultures exposed to different environmental stressors are presented. In a first section, prostate cancer cells were long-term exposed to three endocrine disruptors (aldrin, aroclor 1254 and chlorpyriphos), a class of environmental toxic molecules able to interfere with the normal hormone metabolism. In order to deepen in the epithelial to mesenchymal transition (EMT) observed in some exposed cells, EMT was induced in the same cell culture model and an untargeted lipidomic analysis was performed. EMT is a biological process that plays a crucial role in cancer metastasis, and, at the time of our investigations, little was known about the involvement of lipids in this process. The work presented reports for the first time an increase of many species of triacylglycerides under EMT induction. On the other hand, in the last publications, the untargeted lipidomic studies of primary human epidermal melanocytes and keratinocytes exposed acutely and chronically to ultraviolet (UV) radiation are presented. The UV radiation present in the sunlight has been related to harmful effects on skin such as premature aging and skin cancer. In these works, primary cultures of melanocytes and keratinocytes were exposed to UV radiation in a similar UVA/UVB ratio to that found in solar light. Changes in their phenotypes and lipidomic profiles are described in both cases. Overall, the aim of the present Thesis is to contribute to the knowledge of the effects of environmental stressors to different cell cultures. To unveil these effects, the work presented in this manuscript emphasizes the importance of lipids in the cells response, and proposes the use of the untargeted approach and chemometric analytical methods as the most useful strategy to discover relevant molecules in the processes studied.