Implicacions fisiopatològiques de l'alteració del transportador concentratiu de nucleòsids hCNT1

Abstract

L’entrada de nucleòsids a la cèl·lula està regulada pels transportadors concentratius de nucleòsids (hCNTs, família gènica SLC28) i transportadors equilibratius de nucleòsids (hENTs, família gènica SLC29). S’ha descrit que l’expressió dels hCNTs disminueix en càncer, sobretot hCNT1. La restitució d’hCNT1 en models tumorals indueix canvis a la cèl·lula de caràcter supressor de tumor, i es donen independentment de la seva capacitat transportadora; per aquest motiu està classificat com a transceptor. Així, s’ha hipotetitzat que la desregulació d’hCNT1 és un esdeveniment primerenc en el procés de carcinogènesi. Per tant, l’objectiu principal d’aquesta tesi és elucidar els mecanismes de regulació d’hCNT1. Es va estudiar la base genètica de l’uridina-citidinúria en un pacient que presentava febre, hepatosplenomegàlia, acidosi làctica persistent, alteracions dels enzims hepàtics i que finalment va morir per fallada multiorgànica. Es van identificar les variants c.1528C>T (p.R510C) i c.1682G>A (p.R561Q) del gen SLC28A1 (hCNT1). L’anàlisi funcional d’aquestes variants va mostrar que afecten l’estructura tridimensional d’hCNT1, alteren el patró de glicosilació i disminueixen la vida mitjana dels mutants, comprometent l’activitat d’hCNT1. La co-transfecció d’ambdues variants, emulant la disposició al·lèlica trans del pacient, va mostrar disminució de l’activitat d’hCNT1. Un anàlisi posterior va identificar dues variants patogèniques del gen PRF1, indicant que el pacient també tenia Limfohistiocitosi Hemofagocítica Familiar tipus 2. Per tant, el pacient presentava un fenotip agreujat per la co-existència de dos defectes monogènics. En un estudi previ del grup utilitzant MYTH s’havia identificat l’E3 lligasa RNF41 com a proteïna d’interacció d’hCNT1. L’anàlisi del possible paper fisiològic va mostrar que la modulació d’RNF41 induïa canvis en l’activitat d’hCNT1, de manera que es va hipotetitzar que RNF41 ubiqüitinava hCNT1. Estudis d’inhibició del proteasoma amb hCNT1K19R (la lisina candidata mutada) no van mostrar canvis respecte hCNT1 WT. La interacció podria tenir altres funcions, com promoure el reciclatge d’hCNT1. Per altra banda, la pèrdua d’expressió dels hCNTs en càncer va propiciar l’estudi dels mecanismes de regulació dels gens corresponents. Així, es va determinar que l’estat de l’epigenoma condicionava l’expressió dels transportador, concretament l’acetilació de les histones. Es va tractar un panell de línies cel·lulars tumorals amb SAHA, un inhibidor d’histona desacetilases, i es va detectar increment de l’expressió dels transportadors hCNT1 i hCNT2 a temps curts que es traduïa en un augment d’activitat dependent dels hCNTs.

Per estudiar els elements que podrien regular l’expressió d’hCNT1 es va clonar la regió promotora del gen SLC28A1, l’activitat del qual depèn del context cel·lular. La regió amb major activitat promotora corresponia a un fragment de 400pb situat 1695pb downstream respecte l’inici de transcripció (TSS). Es van identificar els factors de transcripció STAT3, YY1, KLF6, p53 i E2F1 com a candidats a la regulació d’SLC28A1. Es va detectar que l’estat de p53 condicionava l’activitat del promotor d’SLC28A1. L’expressió heteròloga de KLF6 produïa una tendència d’increment d’expressió d’hCNT1 a nivell d’mRNA i cert augment del transport concentratiu. Es va identificar que KLF6 s’unia al promotor d’SLC28A1 a -470pb respecte el TSS. Per últim, s’ha relacionat l’eix CDK4-pRb-E2F1 amb l’expressió dels transportadors de nucleòsids. La inhibició de CDK4 amb abemaciclib produïa un augment d’expressió a nivell d’mRNA dels transportadors concentratius a temps curts, mentre que l’expressió d’hENT1 disminuïa. Per hCNT1 i hENT1 aquests canvis eren efectuats per E2F1, el qual s’ha demostrat que s’uneix al promotor d’SLC28A1 i SLC29A1. En silenciar E2F1, l’expressió d’hCNT1 i hENT1 augmentava, mentre que en sobreexpressar-lo, l’expressió d’hCNT1 era disminuïda. Per tant, E2F1 podria estar contribuint a la regulació de l’expressió coordinada dels transportadors hCNT1 i hENT1.

Nucleoside transporters are divided in two gene families: SLC28, encoding the Concentrative Nucleoside Transporters (hCNT), and SLC29, encoding the Equilibrative Nucleoside Transporters (hENT). These proteins are expressed in most cell types, with apparent functional redundancy. It has been described that hCNTs expression, especially hCNT1, is downregulated in cancer. hCNT1 restoration in pancreatic cancer models altered signaling pathways, reduced cell migration and cell cycle progression, and induced non-apoptotic cell death, in a substrate translocation-independent manner. Thus, hCNT1 is considered a transceptor. Here we aim to elucidate what mechanisms regulate hCNT1 activity and SLC28A1 expression. A clinical case was presented with uridine- cytidineuria, fever, hepatosplenomegaly, persistent lactate acidosis, severely disturbed liver enzymes and ultimately multiorgan failure. Genetic analysis revealed two variants in SLC28A1 (hCNT1), c.1528C>T (p.R510C) and c1682G>A (p.R561Q). Functional analysis showed that these variants affected the three-dimensional structure of hCNT1, altered glycosylation and decreased the half-life of the mutant proteins which resulted in impaired transport activity. Co-transfection of both variants, mimicking the allelic trans disposition in the patient, significantly impaired hCNT1 biological function. The patient was also suffering from Familial Hemophagocytic Lymphohistiocytosis type 2. The identification of two co-existing monogenic defects might have resulted in a blended phenotype. Further analysis of hCNT1 protein revealed RNF41 as an interactor protein. We hypothesized that RNF41 being an E3 ligase was targeting hCNT1 for proteasomal degradation. However, we also proposed that the interaction could also be related to other functions, such as hCNT1 recycling. Studies with the epigenetic drug SAHA revealed that acetylated lysins are involved in hCNT1 expression for the first time. We also identified the SLC28A1 promoter, which presents different activity depending on the cellular context. A 400bp fragment 1695bp downstream of the transcription start site (TSS) exhibits the highest activity, especially in liver- derived tumoral cell lines. Analysis of the transcription factor putative binding sites revealed STAT3, YY1, KLF6, p53 and E2F1 as candidates for SLC28A1 expression regulation. p53 status of the cell lines conditions SLC28A1 promoter activity. KLF6 was found to bind 470bp upstream to SLC28A1 TSS. The CDK4-pRb-E2F1 axis modulates nucleoside transporters expression through E2F1, which binds to both SLC28A1 and SLC29A1 promoters, exerting repressive effects.