Paper de la proteïna p27 en la regulació de l'expressió de l'α-sinucleïna: Implicacions en la malaltia de Parkinson

Abstract

El nostre grup ha identificat prèviament diferents gens i programes transcripcionals regulats per la proteïna p27. En aquest treball ens centrem en el paper de la proteïna p27 en la regulació a nivell transcripcional de l’expressió del gen que codifica per l’α-sinucleïna (gen SNCA), una proteïna molt important en el desenvolupament de la malaltia de Parkinson. Específicament, l’α-sinucleïna forma agregats en regions concretes del cervell. En aquest treball hem comprovat que les cèl·lules deficients de p27 presenten nivells més elevats d’α-sinucleïna. Per altra banda, en cervells de ratolins KO de p27 també observem un augment de l’expressió d’α-sinucleïna. Addicionalment, mitjançant la tècnica de silenciament gènic CRISPR/Cas9 vam obtenir línies cèl·lules KO de p27 i E2F4 i en aquestes cèl·lules també s’observa un augment de l’α-sinucleïna. Posteriorment, hem descrit, mitjançant experiments de ChIP i de luciferases, la regulació a nivell transcripcional de p27 del gen SNCA en associació a diferents factors de transcripció, C/EBPδ i E2F4/p130. En ambdós casos l’expressió de p27 reprimeix l’expressió del gen SNCA. A més a més, mitjançant shRNAs i la tècnica de Proximity Ligation Assay (PLA) hem observat com la disminució dels nivells de p27 i p130 també augmenten l’agregació de l’α-sinucleïna. També hem identificat CDK5 com una possible quinasa encarregada de fosforil·lar a p27 i exportar-ho al citoplasma on no pot exercir la seva funció com a regulador transcripcional. Finalment, mitjançant shRNAs vam disminuir els nivells de CDK5, en aquestes cèl·lules i amb la tècnica de PLA hem aconseguit veure com la supressió de CDK5 provoca un augment en l’agregació de l’α-sinucleïna. Com està descrit que CDK5 és capaç d’interaccionar amb els complexes E2F1/pRB, hem caracteritzat la unió de p27 a E2F1 mitjançant columnes cromatogràfiques i hem establert que E2F1 s’uneix a al extrem final de p27, entre els aminoàcids 160-198, de manera similar a la que s’uneix amb E2F4.

Our group has identified different transcriptional programs regulated by the protein p27. In this work we focus on the role of p27 in the transcriptional regulation of the gene that encodes for α-synuclein (SNCA gene), a very important protein involved in Parkinson’s disease. Specifically, α-synuclein forms aggregates in specific regions of the brain. In this thesis, we found that p27-deficient cells have higher levels of α-synuclein. On the other hand, in brains of p27 KO mice we also observed an increase in α-synuclein levels in some brain regions. Additionally, using the CRISPR/Cas9 gene silencing technique we obtained KO cell lines of p27 and E2F4 and in these cell lines we also observe an increase of α-synuclein. Subsequently, through ChIP and luciferase assays, we described the transcriptional regulation of p27 of the SNCA gene in association with two different transcription factors, C/EBPδ and E2F4/p130. In both cases, p27 expression supresses SNCA expression. Furthermore, using shRNAs and the Proximity Ligation Assay (PLA) technique, we observed how the decrease of p27 and p130 protein levels also increased α-synuclein aggregation levels. We have also identified CDK5 as a kinase that phosphorylates p27 and cause it exportation to cytoplasm where it cannot function as a transcriptional regulator. Finally, using shRNAs we decreased the levels of CDK5 in these cells and with PLA we were able to see how the decrease of CDK5 levels causes an increase in α-synuclein aggregation levels. As it is described that CDK5 can interact with E2F1/pRb complexes, we have characterized the binding of p27 to E2F1 by affinity chromatography assays and we established that, as occurs with E2F4, E2F1 binds to the carboxyl moiety of p27, between aminoacids 160-170.