Chemical design and validation of Ca 2+ -releasing platforms to promote vascularization in tissue regeneration

Abstract

An insufficient vascularization of the wound site is often the cause of failure in tissue regeneration. The use of cell therapy or growth factors has introduced promising results, nevertheless, they are risky, expensive and difficult to store. Synthetic biomaterials offer an alternative, reducing these limitations but also decreasing the positive effects. Among synthetic materials, degradable calcium phosphates have demonstrated an efficient bioactivity. Their partial dissolution towards the surrounding tissue induces several positive responses including cell migration, proliferation and even osteogenic differentiation. What is not so well understood is their angiogenic (formation of blood vessels from pre-existing ones) potential. Recent findings in our group indicates that their Ca2+ release is involved in the cell synthesis of angiogenic factors. Based on this finding, in this thesis, we synthesized binary (P205-Ca0) calcium phosphate glass (CPg) degradable nanoparticles by the sol-gel method and tested and validated their angiogenic potential. Interestingly, this is the first time that binary (P205-Ca0) CPg nanoparticles have been synthesized by the sol-gel method. We used ethylphosphate and calcium 2-methoxyethoxide as sol-gel precursors, and we catalyzed the precipitation of the particles using NH3(aq) in an ethanolic medium. Nuclear magnetic resonance supplemented with other characterization techniques, showed that the particles were a mixture of highly soluble amorphous calcium monoethylphosphate with the formation of portlandite or NH4H2P04 for an excess or the absence of Ca respectively. After a thermal treatment at 200 or 350°C, the highly soluble organic particles were converted into a more stable (but still degradable) inorganic amorphous calcium trimetaphosphate (ACTMP), pyrophosphate (ACPP), orthophosphate (ACP) and calcite as the Ca content of the particles increased respectively. We controlled the ion release of the particles under physiological conditions by modifying their Ca/P ratio and applying this moderately low thermal treatment. The CPg nanoparticles were combined with electrospun polylactic acid nanofibers to achieve an implantable scaffold. These Ca2+ releasing scaffolds showed promising results in angiogenesis, including a similar blood vessel formation than significant VEGF doses in the chick chorioallantioc membrane model. The scaffolds also induced a stronger osteogenic differentiation, and a significant skin ulcer reduction in diabetic and obese mice, that validates their use not only for bone but also for the healing of highly vascularized softer tissues such as the skin. Concluding, we demonstrated that the use of synthetic Ca2+ releasing scaffolds offers a cost-effective alternative for the regeneration of highly vascularized tissues.

La principal causa de fracàs en el camp de l'enginyeria de teixits ve donada per una insuficient vascularització de la ferida a tractar. L'ús de teràpia cel·lular o factors de creixement ha introduït resultats prometedors. No obstant, existeix un alt risc associat a la seva utilització a més de tenir un preu elevat i limitacions d'emmagatzematge. L'ús de biomaterials sintètics ofereix una alternativa més segura i econòmica però alhora biològicament menys potent. Entre els biomaterials sintètics cal destacar l'ús de fosfats de calci degradables, els quals han demostrat ser biològicament actius. La seva dissolució parcial cap el teixit circumdant és capaç d'estimular respostes biològiques favorables, incloent-hi migració, proliferació i fins tot la diferenciació osteogènica de cèl·lules mare mesenquimals. El que no és tan conegut és el seu potencial angiogènic (formació de vasos sanguinis a partir de ja existents). Estudis recents en el nostre grup indiquen que l'alliberació de Ca2+ provocada per la seva degradació, està estretament involucrada en la síntesi cel·lular de factors de creixement angiogènics com ara el VEGF.Basant-nos en aquest descobriment, en aquesta tesi ens hem centrat a estudiar el procés de síntesi per optimitzar l'obtenció de nanopartícules degradables de vidre de fosfat de calci (CPg) en un sistema binari (P205-CaO) pel mètode sol-gel, i hem mesurat i validat el seu potencial angiogènic. Curiosament, aquesta és la primera vegada que es sintetitzen i caracteritzen nanopartícules de CPg en un sistema binari (P205-CaO) pel mètode sol-gel. Per a sintetitzar les nanopartícules hem fet servir etilfosfat i calci 2-metoxietòxid com a precursors, i hem catalitzat la reacció amb NH3(ac) en un medi etanòlic. La caracterització de les partícules per ressonància magnètica nuclear i altres tècniques complementaries mostren la presència d'una fase altament soluble de monoetilfosfat de calci amorf amb la formació de portlandita o NH4H2P04 cristal·lí per a l'excés o absència de Ca respectivament Després d'un tractament tèrmic a 200 o 350 °C, les altament soluble nanopartícules orgàniques son convertides en més estables però encara degradables nanopartícules inorgàniques de trimetafostat, pirofosfat i ortofosfat de calci amorf, amb l'adició de calcita a mesura que el contingut de Ca de les partícules va augmentant respectivament. Aquest nou mètode de síntesi a baixa temperatura ens ha permès controlar l'alliberació de Ca2+ modificant la relació Ca/P de les partícules. Les nanopartícules han estat combinades amb nanofibres d'àcid polilàctic, utilitzant la tècnica de l'electrofilat, per tal de crear bastides implantables que mimetitzin la morfologia de la matriu extracel·lular del cos. Aquestes bastides alliberadores de Ca2+han mostrat diverses millores a nivell angiogènic, incloent-hi una similar vascularització en embrions de pollastre (CAM model) que dosis significatives de VEGF. Les bastides també induïren una major diferenciació osteogènica in vitro i paral·lelament una cicatrització cutània en ratolins diabètics i obesos significativament més rapida que apòsits de Mepilex®, actualment utilitzats en el tractament clínic de ferides cròniques de pell, com per exemple úlceres. Ambdós resultats suggereixen l'ús de les bastides no només per a la consolidació de fractures òssies sinó també per a teixits més tous amb un alt nivell de vascularització, com ara la pell. Per concloure, en aquesta tesi es mostren indicis que indiquen que l'ús de bastides sintètiques alliberadores de Ca2+ pot ser una alternativa efectiva i econòmica pera la regeneració de teixits que requereixin d'una alta vascularització.