Conformational catalytic itineraries of five- and six-membered sugar rings in enzymatic and superacid media

Abstract

Carbohydrates were early considered important for energy storage and structural support for living organisms. It was not until a few decades ago that scientist discovered that they are also involved in much more complex mechanisms, such as modulating protein structures, locating and signalling in multicellular systems and cell-cell recognition, including bacterial and virus infections and in some aspects of cancer. Consequently, carbohydrates are getting more recognition, being used in drug delivery strategies, vaccines and new therapeutics for treating many types of diseases. Carbohydrates come in many stereochemistries, configurations and conformations which converts them into very complex molecules to study. The vast amount of carbohydrate-based structures in nature needs a larger number of enzymes responsible of their degradation, synthesis and possible modifications. These are named as carbohydrate-active enzymes (CAZymes), which include glycoside hydrolases, glycosyltransferases, polysaccharide lyases and carbohydrate esterases. This Thesis focuses on glycosyl hydrolases (GHs), which are responsible for the hydrolysis of glycosidic bonds. The possible sugar ring conformations that carbohydrates can adopt in the enzyme active sites during catalysis depends on the distinct active site topologies found for the more than 150 GH families. Each GH (or each family of GHs) hosts a particular catalytic conformational itinerary of the corresponding carbohydrate substrate. Understanding these itineraries is of great importance when designing selective inhibitors, as some of the most powerful inhibitors mimic the structure and properties of the transition state (TS) of the hydrolysis reaction. Molecular mechanisms and catalytic conformational itineraries of GHs can be investigated with both experimental and computational approaches. Typically, an initial structure of the GH enzyme is needed to further perform computational analyses to elucidate the electronic and conformational changes along the catalytic itinerary of the carbohydrate substrate. In this Thesis we will focus on two GHs of biochemical and biotechnological relevance, which the catalytic conformational itineraries were still unknown, the β-D-galactocerebrosidase (GALC) and α-L-arabinofuranosidase Aspergillus kawachii abfB (AkAbfB). These GHs act on carbohydrates formed by five and six-membered rings (derivatives of β-D-galactose and α-L-arabinose, respectively). Additionally, and motivated by recent NMR experiments of isolated glycosyl cations, we analyse the properties of five-and six- membered glycosyl cations in different environments; in vacuum, in superacid media and on- enzyme.

Els carbohidrats no només són una eina d’emmagatzematge d’energia i de suport estructural dels éssers vius, sinó també actuen en mecanismes molt més complexos, com la localització i senyalització en sistemes multicel·lulars i el reconeixement entre cèl·lules, incloent-hi infeccions causades per bacteris i virus. Consegüentment, s’està donant més reconeixement als carbohidrats, utilitzant-los dins del camp dels fàrmacs per tractar molts tipus de malalties. Els carbohidrats presenten estereoquímiques, configuracions i conformacions molt variades, cosa que els converteix en unes molècules molt complexes d’estudiar. Aquesta gran varietat fa que existeixi també una gran quantitat d’enzims, anomenats “enzims actius en carbohidrats”, que s’encarreguen de la seva degradació, la seva síntesis i les seves possibles modificacions. Aquesta Tesi s’ha centrat en les glicosidases, responsables d’hidrolitzar els enllaços glicosídics. Les possibles conformacions que poden adoptar els anells de sucre en el centre actiu d’aquests enzims depenen de les diferents topologies que es troben en les més de 150 famílies de glicosidases. Cada glicosidasa opera amb un itinerari conformacional particular del corresponent substrat. El coneixement d’aquests itineraris és de gran importància en el disseny selectiu d’inhibidors, ja que alguns dels inhibidors més potents imiten l’estructura i les propietats de l’estat de transició de la reacció d’hidròlisi. Els mecanismes moleculars i els itineraris conformacionals de les glicosidases es poden investigar tant amb mètodes experimentals com amb mètodes computacionals. Usualment, es necessita una estructura inicial d’una glicosidasa per poder després fer anàlisis computacionals per a elucidar els canvis electrònics i conformacionals que pateix el sucre al llarg de l’itinerari catalític. En aquesta Tesi, ens centrarem en dues glicosidases de rellevància bioquímica i biotecnològica, de les quals l’itinerari conformacional era encara desconegut: la β-galactocerebrosidasa (GALC) i l’α-L-arabinofuranosidasa Aspergillus kawachii abfB (AkAbfB). Aquestes glicosidases actuen en carbohidrats formats per anells de cinc i de sis àtoms de carboni (derivats de la β-D-galactosa i l’α-L- arabinosa, respectivament). Per últim, i motivat per experiments recents de caracterització de cations de glicosil en medi superàcid, s’analitzen aquests cations, tant per a sucres de cinc com de sis àtoms de carboni en diferents entorns: en el buit, en medi superàcid i dins d’un enzim.