Novel planar photonic antennas to address the dynamic nanoarchitecture of biological membranes

Abstract

The cell membrane is the encompassing protective shield of every cell and it is composed of a multitude of proteins, lipids and other molecules. The organization of the cell membrane is inextricably intertwined with its function, and sensitive to perturbations from the underlying actin cytoskeleton and the extracellular environment at the nano- and the mesoscale. Elucidating the dynamic interplay between lipids and proteins diffusing on the cell membrane, forming transient domains and (re)organizing them according to signals from the juxtaposed inner and outer meshwork, is of paramount interest in fundamental cell biology. The overarching goal of this thesis is to gain deeper insight into how lipids and proteins dynamically organize in biological membranes at the nanoscale. Photonic nano-antennas are metallic nanostructures that localize and enhance the incident optical radiation into highly confined nanometric regions (< 20 nm), leading to greatly enhanced light-matter interactions. In this thesis, we exploit an innovative design of planar gold nano-antenna arrays of different gap sizes (10-45 nm) and embedded in nanometric-size boxes. To elucidate nanoscale diffusion dynamics in biological membranes with high spatiotemporal resolution and single-molecule detection sensitivity, we further combine our nanogap antenna arrays with fluorescence correlation spectroscopy (FCS) in a serial and multiplexed manner. In this dissertation, we first describe the fabrication process of these planar gold nanogap antennas and characterize their performance by means of electron microscopy and FCS of individual molecules in solution. We demonstrate giant fluorescence enhancement factors of up to 104-105 times provided by our planar nanogap antennas in ultra-confined detection volumes and with single molecule detection sensitivity in the micromolar range. Second, we apply these planar plasmonic nano-antennas in combination with FCS for assessing the dynamic organization of mimetic lipid membranes at the nanoscale. For a ternary composition of the model membranes that include unsaturated and saturated lipids together with cholesterol, we resolve transient nanoscopic heterogeneities as small as 10 nm in size, coexisting in both macroscopically phase-separated lipid phases. Third, we add a Hyaluronic Acid (HA) layer on top of the model lipid membranes to emulate the effect of the extracellular environment surrounding native biological membranes. We extend our nano-antenna-FCS approach with atomic force microscopy and spectroscopy. We reveal a distinct influence of HA on the nanoscale lipid organization of mimetic membranes composed of lipids constituting the more ordered lipid phase. Our results indicate a synergistic effect of cholesterol and HA re-organizing biological membranes at the nanoscale. Fourth, we apply our planar nano-antenna platform combined with FCS to elucidate the nanoscale dynamics of different lipids in living cells. With our nanogap antennas we were able to breach into the sub-30 nm spatial scale on living cell membranes for the first time. We provide compelling evidence of short-lived cholesterol-induced ~10 nm nanodomain partitioning in living plasma membranes. Fifth, we demonstrate the multiplexing capabilities of our planar gold nanogap antenna platform combined with FCS in a widefield illumination scheme combined with sCMOS camera detection. Our approach allows recording of fluorescence signal from more than 200 antennas simultaneously. Moreover, we demonstrate multiplexed FCS recording on 50 nano-antennas simultaneously, both in solution as well as in living cells, with a temporal resolution in the millisecond range. The dissertation finishes with a brief discussion of the main results achieved in this research and proposes new avenues for future research in the field.

La membrana plasmática separa el entorno intracelular del extracelular y está compuesta por una multitud de diferentes proteínas y lípidos. Su organización está fuertemente interconectada a su función, y es sensible a perturbaciones tanto de la actina cortical posicionada internamente en proximidad con la membrana, así como de una red extracelular en contacto próximo con la membrana exterior. Estas perturbaciones ocurren a distintas escalas temporales y espaciales, llegando a unos pocos nanómetros. Dada la estrecha relación entre la organización de la membrana y su función biológica, es tremendamente importante entender como lípidos y proteínas se organizan dinámicamente a la escala nanométrica y como se ven afectados por su entorno. El objetivo principal de esta tesis doctoral se centra en alcanzar este entendimiento. Las antenas fotónicas son nano-estructuras metálicas que incrementan la radiación electromagnética en regiones nanométricas (< 20 nm) del espacio. En esta tesis doctoral, hemos fabricado y utilizado plataformas con matrices de antenas en oro, y con regiones de confinamiento entre 10-45 nm. Además, hemos combinado estas antenas con la técnica de ¿fluorescence correlation spectroscopy (FCS)¿ a fin de obtener información espaciotemporal a la nano-escala en membranas biológicas, junto a la sensibilidad de detectar moléculas individuales a altas concentraciones. En esta disertación, describimos primero la fabricación de antenas fotónicas y caracterizamos su rendimiento utilizando técnicas de microscopía electrónica y FCS de moléculas individuales en solución. Nuestros resultados demuestran factores de incremento de la fluorescencia entre 104-105, en regiones ultra-confinadas, y una capacidad para detectar moléculas individuales en rango de concentraciones de micro-molares. Una vez validadas nuestras herramientas, nos enfocamos en su uso para el estudio dinámico de la organización de membranas lipídicas miméticas a escala nanométrica. En el caso de composiciones ternarias de lípidos insaturados, saturados y colesterol, hemos descubierto la existencia de heterogeneidades nanoscópicas y transitorias que coexisten tanto en las regiones ordenadas como desordenadas de las membranas lipídicas. El siguiente capítulo contiene resultados enfocados a estudiar el efecto del entorno extracelular en la organización dinámica de este tipo de capas lipídicas. Para ello, y como modelo, preparamos membranas lipídicas cubiertas de ácido hialurónico (HA), un componente abundantemente expresado en la matriz extracelular. Combinando FCS con microscopia y espectroscopia de fuerzas atómicas, logramos resolver la influencia de HA a escala nanométrica en la organización de la fase ordenada de las membranas lipídicas. Nuestros resultados indican la existencia de un efecto sinérgico entre HA y colesterol en el reordenamiento de la membrana a la nano-escala. El siguiente tema de investigación en esta tesis doctoral se enfoca a la aplicación de antenas fotónicas y FCS para el estudio de dominios lipídicos enriquecidos de colesterol en la membrana plasmática de células vivas. La utilización de estas antenas nos ha permitido, por primera vez, remontar la barrera de 30 nm, y demostrar de manera inequívoca la existencia de dominios enriquecidos en colesterol en células vivas con una resolución espacial de 10 nm. Finalmente, hemos demostrado la capacidad de multiplexado de nuestras antenas fotónicas, combinando una iluminación y detección en campo amplio utilizando una camera sCMOS. Describimos la implementación de nuestro esquema, así como también medidas que demuestran la detección simultánea de fluorescencia en más de 200 antenas. De manera importante, demostramos la obtención de curvas de FCS en 50 antenas simultáneamente, tanto en solución como en células vivas. Esta disertación culmina con una breve discusión de los resultados más importantes de esta investigación en el futuro