Strategies to induce vascularization: angiogenesis stimulation and tissue engineering blood vessels

Abstract

Angiogenesis, which results in a capillary network formation, is one of the crucial events that take place when there is tissue damage, being critical for successful tissue regeneration. It does not only allow the arrival of oxygen, nutrients and waste removal, but it also allows the arrival of progenitor cells necessary to induce tissue restoration. However, when there is an excessive damage, tissues are unable to regenerate by themselves. During the last decades, tissue engineering emerged as an alternative to improve tissue regeneration, with the combination of biomaterials (which serves as scaffolds), cells and/or stimulatory molecules. Therefore, one of the aims of tissue engineering is to incorporate stimulatory molecules within scaffolds to promote blood vessel formation for successful tissue regeneration and integration. Alternatively, there are some clinical situations in which high caliber vessels are needed instead of capillary network formation. An example would be with cardiovascular diseases (CVD), such as atherosclerosis or aneurysms, in which blood vessel replacement is needed. Autologous and xenogeneic grafts present some limitations, mainly risk of disease transmission and shortage of donors. Therefore, tissue engineered blood vessels (TEBVs) emerged as a promising alternative. Regarding angiogenesis, generally, growth factors have been incorporated within scaffolds as molecules of choice to stimulate blood vessel formation. Although they have demonstrated a proper angiogenic response, they present some limitations, such as delicate handling properties and short half-life. As naturally found in human body, ions have demonstrated to be a promising alternative, being able to stimulate cellular functions, such as blood vessel formation. However, sometimes there is no consensus about the appropriate non-toxic and therapeutic doses, due to a lack of concentration screening studies before introducing them into the scaffolds. Regarding TEBVs, different approaches have been described for their development. However, they usually include several manufacturing steps and additional biomaterial patterning or additional stimulus to acquire native vascular cell alignment. This thesis is focused on angiogenesis stimulation and TEBVs, divided in two main blocks: i) development of a drug delivery system (DDS) with the incorporation of ions to stimulate early phases of bone regeneration, including angiogenesis; ii) development of TEBVs through extrusion-based approach. In the first part, an initial screening of different concentrations of therapeutic ions was performed to assess non-toxic and therapeutic concentrations in angiogenesis and osteogenesis, with endothelial cells (ECs) and human mesenchymal stem cells (hMSCs), respectively. Results allowed establishing therapeutic doses of both ions for blood vessel formation, although they showed impairment when tested for osteogenic differentiation. These ions were then incorporated within a biomaterial to allow forming a DDS, showing that the incorporated therapeutic ions could have antibacterial and angiogenic potential, allowing a sequential delivery of both ions. The designed DDS consisted of a fiber like structure incorporating hydroxyapatite based microparticles which could potentially be used for bone tissue regeneration. In the second part, TEBVs were successfully developed with extrusion-based approach in one single step procedure. Moreover, specific vascular cell types were incorporated, with high cell survival and presenting native cell alignment and some vasoactive functionality. Furthermore, we could improve their mechanical properties by extruding TEBVs with high concentrations of collagen, allowing their perfusion with arterial shear stress. Further studies are required to prove their functionality and maturation, with the potential to be used as blood vessel replacement or even vascular disease modeling

L’angiogènesis, que dona lloc a la formació de xarxes capil·lars, és un dels esdeveniments més importants que té lloc quan hi ha dany als teixits, sent fonamental per aconseguir la regeneració dels teixits. No només permet l’arribada d’oxigen, nutrients i eliminació de residus, sinó que també permet l’arribada de cèl·lules progenitores necessàries per induir la restauració dels teixits. Tot i així, quan es produeix un dany gran, els teixits no poden regenerar-se per si mateixos. En les darreres dècades, l’enginyeria tissular va sorgir com una alternativa per millorar la regeneració de teixits, amb la combinació de biomaterials (que serveixen com a bastides), cèl·lules i/o molècules estimuladores. Així doncs, un dels objectius de l’enginyeria de teixits és la incorporació de molècules estimuladores en els biomaterials per promoure la formació de vasos sanguinis per aconseguir amb èxit la regeneració de teixits i la seva integració en l’hòspeda. Alternativament, hi ha algunes situacions clíniques en les que es necessita vasos sanguinis grans en comptes de xarxes capil·lars. Un exemple el trobem amb les malalties cardiovasculars, com l’arterioescleròsi o aneurismes, en els quals és necessari un recanvi del vas sanguini. Els empèlts autòlegs i xenogènics s’han usat com a material substitutori, però presenten algunes limitacions, principalment el risc de transmissió de malalties i escassetat de material o donants. Així doncs, l’enginyeria tissular de vasos sanguinis va sorgir com una alternativa prometedora. Generalment, pel que fa l’angiogènesis, els factors de creixement s’han incorporat en els biomaterials com a molècules d’elecció per estimular la formació de vasos sanguinis. Tot i que han demostrat induir una resposta angiogènica adequada, presenten algunes limitacions, com ara propietats delicades per la seva manipulació i una vida de curta durada. Per altra banda, els ions, que es troben de manera natural en el cos humà, han demostrat ser una alternativa prometedora, ja que són capaços d’estimular funcions cel·lulars com seria la formació de vasos sanguinis. Tanmateix, no hi ha un ampli consens respecte les concentracions apropiades que no siguin tòxiques i que indueixin un efecte terapèutic, degut a la falta d’estudis previs on es faci un cribatge abans d’introduir-los en els biomaterials. Pel que fa a l’enginyeria tissular de vasos sanguinis, s’han descrit diferents metodologies per desenvolupar-los. Tot i així, aquests mètodes inclouen diversos passos i l’addició de patrons addicionals en els biomaterials o estímuls addicionals per induir l’alineament cel·lular similar als vasos nadius. Aquesta tesi es centra en l’estimulació de l’angiogènesi i l’enginyeria tissular de vasos sanguinis, dividida en dos blocs principals: i) el desenvolupament d’un sistema d’alliberació de fàrmacs amb la incorporació de ions per estimular fases primerenques de la regeneració de l’ós, incloent l’angiogènesi; ii) el desenvolupament de vasos sanguinis per enginyeria tissular mitjançant un mètode basat en l’extrusió. En la primer part, es va fer inicialment un cribatge amb diferents concentracions de dos tipus de ions terapeutics per determinar quin rang de concentracions no eren tòxiques i tenien un efecte terapèutic en l’angiogenesi i l’osteogènesis, usant cèl·lules endotelials i cèl·lules mesenquimals humanes, respectivament. Els resultats obtinguts van permetre establir un rang de concentracions terapèutiques dels dos ions per la formació de vasos sanguinis, però van mostrar un efecte deleteri quan es van usar per induir la diferenciació òssia. Posteriorment, es va desenvolupar un sistema d’alliberació de fàrmacs on es van incorporar aquests ions, demostrant que els ions terapèutics incorporats poden tenir un potencial antimicrobià i angiogènic, permetent l’alliberació seqüencial d’ambdós ions. El sistema d’alliberació de fàrmacs dissenyat consistia en una estructura similar a una fibra incorporant micropartícules amb contingut d’hidroxiapatita que potencialment es podria utilitzar per la regeneració de teixit ossi. En la segona part, els vasos sanguinis desenvolupats per enginyeria tissular van ser creats satisfactoriament mitjançant el mètode d’extrusió, involucrant un sol pas. A més a més, es va poder incorporar els tipus cel·lulars vasculars específics, amb una alta taxa de viabilitat i presentant l’alineament cel·lular nadiu i certa functionalitat vasoactiva. Posteriorment, es va poder millorar les propietats mecàniques extruint aquests vasos amb concentracions altes de col·lagen, permetent la seva perfusió amb un shear stress arterial. Es requereixen estudis addicionals per demostrar la seva funcionalitat i maduració, amb el potencial de ser usats com a reemplaçament de vasos sanguinis o, fins i tot, com a model de malalties vasculars.