Significant roles of ITGB3 in the tumour microenvironment: EMT driver in hypoxic conditions and central axis in intercellular communication

Abstract

La tesi està composta per dos articles publicats amb data de 12 de desembre de 2017 i 26 d’agost de 2020. Tots dos articles han estat admesos per formar part d’aquesta tesi en el seu format de compendi d’articles per la Comissió Acadèmica de el Programa de Doctorat de Cirurgia i Ciències Morfològiques, en la línia d’investigació d’Anatomia Patològica, amb data de 28 de juliol de 2020. El treball aquí presentat està dividit en diferents apartats; el primer d’ells consta d’una introducció conjunta on es presenten els antecedents i coneixements previs en els quals es basen les hipòtesis i els objectius exposats tot seguit. A continuació, l’apartat de resultats està dividit en dos grans capítols on en cada un d’ells es despleguen els articles que formen la tesi. En el primer capítol es presenta un estudi amb el qual es pretenia identificar factors que a través de la seva regulació traduccional, sota condicions d’estrès hipòxic i de bloqueig de la via canònica de la síntesi proteica, fossin capaços de conferir resistència a aquestes condicions. Per a això es va dur a terme un RNA-Seq d’ARN polisòmic en condicions de: 1) normòxia, 2) hipòxia (0,5% d’oxigen), 24h., 3) normòxia + PP242 i 4) hipòxia + PP242, un conegut inhibidor de mTORC1 / mTORC2. La Integrina Beta 3 (ITGB3) va ser un dels candidats obtinguts. Posteriors estudis van demostrar que la seva inhibició, i de manera més categòrica en hipòxia, no només va augmentar l’apoptosi i va reduir la supervivència i la migració cel·lular, sinó que ITGB3 era requerida per a l’activació sostinguda de la via de TGF-β. Tot això sumat al fet que la inhibició de ITGB3 va reduir significativament la metàstasi pulmonar i va millorar la supervivència general en ratolins. Cal destacar, que en el primer capítol s’ha afegit un sub-apartat de dades no publicades. Aquests resultats es van obtenir durant la meva estada de tres mesos al laboratori del Professor Alan McIntyre a la Universitat de Nottingham, Anglaterra. Durant aquesta estada, l’article va ser acceptat per la revista i per aquest motiu els resultats obtinguts no van ser afegits a la publicació. El capítol II està centrat en el paper de ITGB3 en la comunicació intercel·lular a través de vesícules extracel·lulars i com la desregulació d’aquesta podria explicar la disminució en l’aparició de metàstasis en cèl·lules amb la integrina inhibida descrita en el capítol I. En aquest estudi, hem definit un paper essencial i fins ara desconegut de ITGB3 en l’absorció de vesícules. El mecanisme funcional que està basat la interacció de ITGB3 amb glucoproteïnes heparan sulfatades (HSPG) i en el procés de reciclatge de les integrines, també ha sigut descrit. La combinació d’ambdós mecanismes permet la captura de vesícules extracel·lulars i la seva internalització mitjançada per endocitosi. A més, en el complex d’internalització són molt importants altres proteïnes com la GTPasa Dinamina i la quinasa d’adhesions focals (FAK). Les dues proteïnes són clau per dur a terme l’endocitosi i la posterior entrada de les vesícules extracel·lulars a la ruta endocítica a través dels endosomes. Conseqüentment, podem afirmar que ITGB3 té un paper central en la comunicació intracel·lular a través de vesícules extracel·lulars, mecanisme que es pressuposa crític durant la metàstasi tumoral. Després de l’apartat de resultats, es continua amb una discussió conjunta dels dos capítols on a més de discutir sobre els resultats obtinguts, es debaten les possibles aplicacions translacionals, majoritàriament amb un enfocament terapèutic. Per acabar, s’exposen les conclusions més rellevants extretes d’aquesta tesi.

La tesis está compuesta por dos artículos, publicados a fecha de 12 de diciembre de 2017 y 26 de agosto de 2020. Ambos artículos han sido admitidos para formar parte de dicha tesis en su formato de compendio de artículos por la Comisión Académica del Programa de Doctorado de Cirugía y Ciencias Morfológicas, en la línea de investigación de Anatomía Patológica, con fecha de 28 de julio de 2020. El trabajo aquí presentado está dividido en diferentes apartados; el primero de ellos consta de una introducción conjunta donde se presentan los antecedentes y conocimientos previos en los cuales se basan las hipótesis y los objetivos expuestos seguidamente. A continuación, el apartado de resultados está dividido en dos grandes capítulos donde en cada uno de ellos se despliegan los artículos que forman la tesis. En el primer capítulo se presenta un estudio con el que se pretendía identificar factores que a través de su regulación traduccional, bajo condiciones de estrés hipóxico y de bloqueo de la vía canónica de la síntesis proteica, fueran capaces de conferir resistencia a dichas condiciones. Para ello se llevó a cabo un RNA-Seq de ARN polisómico en condiciones de: 1) normoxia, 2) hipoxia (0,5% de oxígeno), 24h., 3) normoxia + PP242 e 4) hipoxia + PP242, un conocido inhibidor de mTORC1/mTORC2. La Integrina Beta 3 (ITGB3) fue uno de los candidatos obtenidos. Posteriores estudios demostraron que su inhibición, y de manera más categórica en hipoxia, no solo aumentó la apoptosis y redujo la supervivencia y la migración celular, si no que ITGB3 era requerida para la activación sostenida de la vía de TGF-β. Todo ello sumado a que la inhibición de ITGB3 redujo significativamente la metástasis pulmonar y mejoró la supervivencia general en ratones. Cabe destacar, que en el primer capítulo se ha añadido un sub-apartado de datos no publicados. Estos resultados se obtuvieron durante mi estancia de tres meses en el laboratorio del Profesor Alan McIntyre en la Universidad de Nottingham, Inglaterra. Durante dicha estancia, el artículo fue aceptado por la revista y por este motivo los resultados obtenidos no fueron añadidos a la publicación. El capítulo II está centrado en el rol de ITGB3 en la comunicación intercelular a través de vesículas extracelulares y como la desregulación de ésta podría explicar la disminución en la aparición de metástasis en células con la integrina inhibida descrita en el capítulo I. En este estudio, hemos definido un rol esencial y hasta ahora desconocido de ITGB3 en la absorción de vesículas. El mecanismo funcional que está basado en la interacción de ITGB3 con glucoproteínas heparán sulfatadas (HSPG) y en el proceso de reciclaje de las integrinas también ha sido descrito. La combinación de ambos mecanismos permite la captura de vesículas extracelulares y su internalización mediada por endocitosis. Además, en el complejo de internalización juegan un papel importante otras proteínas como la GTPasa dinamina y la quinasa de adhesiones focales (FAK). Ambas proteínas son clave para llevar a cabo la endocitosis y la posterior entrada de las vesículas extracelulares a la ruta endocítica a través de los endosomas. Consecuentemente, podemos afirmar que ITGB3 tiene un papel central en la comunicación intracelular a través de vesículas extracelulares, mecanismo que se presupone crítico durante la metástasis tumoral. Tras el apartado de resultados, se continúa con una discusión conjunta de ambos capítulos donde además de discutir sobre los resultados obtenidos, se debaten las posibles aplicaciones traslaciones, mayoritariamente con un enfoque terapéutico, de dichos estudios. Para acabar, se exponen las conclusiones más relevantes extraídas de dicha tesis.

The thesis is made up of two articles dated December 12, 2017 and August 26, 2020. Both articles have been admitted to form part of the said thesis in its compendium format of articles by the Academic Commission of the Doctorate Program of Surgery and Morphological Sciences, in the research line of Pathological Anatomy, dated July 28th, 2020. The work presented here is divided into different sections. The first of them consists of a joint introduction where the background and prior knowledge on which the hypotheses and the objectives set forth below are based are presented. Next, the results section is divided into two large chapters where the publications that make up this thesis are displayed. The first chapter refers to the first article already published which aimed to identify factors that through their translational regulation under hypoxic stress conditions and the blockage of the canonical pathway of protein synthesis, were able to confer survival resistance to these conditions. For this, RNA-Seq of polysomal RNA was carried out under conditions of 1) normoxia, 2) hypoxia (0.5% oxygen), 24h., 3) normoxia + PP242, and 4) hypoxia + PP242, a known mTORC1 / mTORC2 inhibitor. Integrin Beta 3 (ITGB3) was one of the obtained candidates. Subsequent studies demonstrated that its inhibition, and more categorically in hypoxia, not only increased apoptosis and reduced survival and cell migration, but that ITGB3 was required for sustained activation of the TGF-β pathway. All of this added to the fact that ITGB3 inhibition significantly reduced lung metastasis and improved overall survival in mice. It should be noted that in the first chapter a sub-section of unpublished data has been added. These results were obtained during my three-month stay in Professor Alan McIntyre’s laboratory at the University of Nottingham, England. During this stay, the article was accepted by the magazine, and for this reason, the obtained results were not added to the publication. Chapter II focuses on the role of ITGB3 in extracellular vesicle-based intercellular communication and how this could explain the decrease in the formation of metastasis in cells with ITGB3 inhibition, described in Chapter I. In this study, we have described an essential and far unknown role of ITGB3 in the absorption of vesicles. The functional requirement is based on the interaction of ITGB3 with Heparan Sulfated Glycoproteins (HSPG) and with the recycling process of the integrins. The combination of both mechanisms allows the capture of extracellular vesicles and their internalization mediated by endocytosis. Also, other proteins such as the GTPase Dynamin and Focal Adhesion Kinase (FAK) play an important role in the internalization complex. Both proteins are key to carrying out endocytosis and the subsequent entry of extracellular vesicles into the endosomes of the endocytic pathway. Thus, ITGB3 has a central role in intracellular communication via extracellular vesicles, proposed to be critical for cancer metastasis. After the results section, a combined discussion of both chapters is presented, where, in addition to discussing the obtained results, we discuss the possible translational applications, mostly with a therapeutic approach. To finish, the most relevant conclusions drawn are exposed.