Caracterització de Sistemes de Partició Cromatogràfics per a la Subrogació de Processos de Biopartició

Abstract

En la present tesi doctoral s’han estudiat i desenvolupat diferents sistemes de partició cromatogràfics per poder estimar diferents propietats de biopartició, tant d’interès ambiental com d’interès farmacèutic. La determinació d’aquestes propietats a partir dels mètodes tradicionals implica l’ús de procediments tediosos, d’un elevat cost i, sovint, èticament qüestionables, ja que s’utilitzen éssers vius. Per aquest motiu, l’ús de mètodes cromatogràfics (automatitzats, ràpids i relativament senzills) per estimar aquests paràmetres és d’un gran interès.

Amb aquesta fi, s’han compilat diferents sistemes cromatogràfics i de biopartició que han estat caracteritzats a partir d’un mateix model el model de paràmetres de solvatació (SPM). Adicionalment, s’han desenvolupat i caracteritzat a partir del mateix model 4 sistemes cromatogràfics: 3 basats en liposomes i microemulsió de preparats de lecitina i un altre basat en una microemulsió formada per bromur de tetradeciltrimetilamoni (TTAB), 1-butanol i heptà. Tots aquests sistemes s’han comparat a partir dels coeficients normalitzats obtinguts de la caracterització pel SPM utilitzant un seguit d’eines matemàtiques i quimiomètriques. Com més similars són els coeficients normalitzats de l’equació de solvatació, més similars són els sistemes comparats. A continuació, per aquells sistemes cromatogràfics que, a priori, podrien subrogar un sistemes de biopartició d’interès, s’han establert correlacions entre la propietat biològica i el logaritme del factor de retenció del compost en el sistema cromatogràfic (k). Després d’avaluar els resultats obtinguts, es pot concloure que la toxicitat envers certs organismes aquàtics (Capgrossos, Fathead Minnow, Daphnia magna, Tetrahymena pyriformis i Streptococcus sobrinus), propietat d’interès mediambiental, pot subrogar-se a partir de 3 sistemes de cromatografia electrocinètica micel·lar i un sistema de cromatografia líquida de fase inversa. Pel que fa a la partició a la pell i la partició octanol-aigua, propietats d’interès farmacèutic, poden subrogar-se a partir de sistemes de cromatografia electrocinètica de microemulsions.

Generalment, aquesta metodologia s’aplica a substàncies neutres i hi ha una manca d’estudis per a substàncies carregades. Però, tenint en compte que la majoria de fàrmacs són compostos àcid-base i que la forma iònica d’un compost presenta habitualment un comportament biològic i químic diferent del de la seva forma neutra, s’ha estudiat la idoneïtat de dos sistemes de cromatografia electrocinètica de microemulsions per estimar el coeficient de distribució octanol-aigua (Do/w) de compostos àcid-base ionitzats. A la literatura ja s’ha demostrat que existeix una bona correlació entre el logaritme del coeficient de partició octanol-aigua (Po/w) i el logaritme del factor de retenció de substancies neutres. Per avaluar la capacitat predictiva d’aquests sistemes per compostos àcid-base, s’han establert perfils k-pH en aquests sistemes per 14 àcids i bases monopròtics. Els resultats obtinguts indiquen que, per obtenir factors de retenció precisos, és recomanable evitar la presència de parells iònics utilitzant una microemulsió amb la mateixa càrrega de l’analit (en aquest cas dodecilsulfat de sodi pels anions i TTAB pels cations). També és necessari introduir un factor de correcció de la viscositat quan es calcula k. S’ha de tenir en compte que per calcular k per a compostos carregats s’ha de determinar la mobilitat electroforètica dels compostos amb i sense la presència de la microemulsió. Tenint en compte que la mobilitat electroforètica està inversament relacionada amb la viscositat, la mobilitat electroforètica pot variar en funció de la viscositat del medi on es mesuri. Tot seguit, a partir del perfils k-pH i de la recta log Po/w-log k establerta per compostos neutres, s’ha estimat el valor de log Do/w de compostos àcid-base a diferents valors de pH i s’ha comparat amb l’obtingut amb els mètodes tradicionals (principalment el mètode shake-flask). Els valors obtinguts a partir de les dues metodologies són similars quan el compost es troba a la

seva forma neutra o parcialment ionitzat (fins el 99%), mentre que el log Do/w s’ha sobreestimat quan el compost es troba totalment ionitzat.

Finalment, a la recerca de nous sistemes cromatogràfics que permetin estimar altres propietats de biopartició, es va realitzar una estada predoctoral a la Vrije Universiteit Brussel (VUB), situada a Brussel·les (Bèlgica). Durant aquest temps es va desenvolupar una columna monolítica basada en un polímer d’estirè-co-divinilbenzè, la qual es va caracteritzar per a la separació de proteïnes a partir de cromatografia líquida de fase inversa per formació de parells iònics.

The determination of biological properties usually implies expensive and complex procedures which sometimes require the use of living beings, a practice ethically questionable. Thus, the use of physicochemical systems that emulate biopartitioning processes would allow the estimation of biological properties in a faster and automated way avoiding in vivo testing.

In the present work, chromatographic and biopartitioning systems characterized in previous works through a same model (the solvation parameter model (SPM)) have been compiled, adding the new developed and characterized systems in the present study. Then, all the systems have been compared using the normalized coeficients resulting from their characterization through the SPM. Finally, correlations between the biological property of interest and the logarithm of the retention factor determined in the best surrogating chromatographic system have been established. The results have shown that toxicity to aquatic species, skin partition, and the octanol-water partition systems can be surrogated employing chromatographic systems based on reserved-phase liquid chromatography and electrokinetic chromatography.

Moreover, since there is a lack of studies regarding ionizable solutes, the feasibility of this methodology to estimate biopartitioning properties for ionized compounds have also been evaluated. Particularly, in the present work, the estimation of the octanol-water distribution coefficient of ionized acid-base substances has been studied. With this aim, retention factor-pH profiles have been established for a set of monoprotic acids and bases. To obtain accurate retention factors, the surfactant used to prepare the microemulsion and the ionized solute have the same charge, and a viscosity correction factor has been used. Then, the retention factor of acid-base compounds has been correlated to log Po/w at several degrees of ionization. Results point out that accurate estimations of the parameter can be achieved up to a 99% of ionization.

Finally, in order to look for new chromatographic systems presenting different selectivities from those reported to the present, an in-house styrene-co-divinylbenzene monolithic capillary column has been developed and characterized for the separation of a mixture of proteins by ion-pairing gradient reversed-phase liquid chromatography.