Análisis cualitativo y cuantitativo de fármacos en peces por espectrometría de masas de alta resolución de cuadrupolo-tiempo de vuelo

Abstract

En la presente tesis doctoral se desarrollaron métodos analíticos para la determinación de fármacos de uso humanos en el tejido muscular de los peces, incluyendo la comparación y optimización de diferentes tipos de extracciones y purificaciones de los extractos. Para la detección y cuantificación, se utilizó la cromatografía líquida (LC) acoplada a la espectrometría de masas de alta resolución (HRMS) en un instrumento QToF, en modo Full MS y SWATH. Las validaciones de los métodos abarcaron hasta 47 fármacos en análisis específicos de 14 familias terapéuticas. Además, se realizó un análisis de compuestos sospechosos utilizando una lista con más de 500 fármacos, metabolitos, drogas de abuso y productos de transformación.

Las dos metodologías analíticas validadas utilizaron la extracción de QuEChERS o la extracción por ultrasonidos. En la primera, a una extracción sólido-líquido le seguía la separación del disolvente orgánico de la fase acuosa mediante salting-out. La limpieza de los extractos tenía como objetivo eliminar el material lipídico, que puede constituir una fracción considerable del tejido de los peces. Los lípidos co-extraidos fueron eliminados con adsorbentes específicos de tipo dispersivo, como el EMR-lipid removal y el adsorbente Z- Sep.

Se aprovechó el modo de adquisición SWATH del instrumento QToF-MS utilizado un modelo Sciex X500R, en el que la adquisicion de datos ultrarrápida alterna entre el modo MS para la detección de iones moleculares con hasta diez adquisiciones secuenciales de fragmentación de todos los iones, cada una de las cuales cubre una ventana de m/z 90-100 Da de amplitud.

Las validaciones de los métodos generales incluyeron los parámetros de recuperación, precisión, efecto de la matriz, reproducibilidad, sensibilidad, robustez y linealidad. El primer método validado realizado con extracción QuEChERS, desarrollado para matrices de músculo de peces liofilizado, a 3 niveles diferentes de concentración hasta 500 ng/g peso seco (dw) de pescado, se aplicó a 16 muestras recogidas en dos ríos europeos. El análisis cuantitativo reveló la presencia de sotalol, carbamazepina, trimetoprima, ketoprofeno, acetaminofén, propranolol y venlafaxina en concentraciones hasta 80 ng/g de pescado (dw).

A diferencia del primer método, la segunda metodología validada incluía también la detección de compuestos por análisis de sospechosos (suspect screening analysis). En este método, se examinaron muestras de pescado fresco (fw) para detectar la presencia de 47 fármacos en modo direccionado validados hasta 50 ng/g de pez (fw). Como complemento del método validado, se incluyeron más de 500 fármacos, drogas de abuso, metabolitos y TPs para el análisis de suspect screening. Los resultados positivos se confirmaron por medio de la base de datos de la biblioteca instrumental,(SCIEX All-In-One HR-MS/MS, biblioteca NIST 2017, y Chemspider), que compilan espectros en alta resolución.

La aplicación de este método a 32 muestras de peces de 4 ríos europeos dió lugar a la detección de bezafibrato, cafeína, carbamazepina, claritromicina, diltiazem, furazolidona, ketoprofeno, sulfapiridina, trimetoprima y verapamilo en concentraciones hasta de 69 ng/g de pescado (fw). Mediante el análisis de suspect screening, se detectaron y confirmaron con éxito en las muestras analizadas benzoilecgonina, cocaína, nicotina y ofloxacina.

Finalmente se estudió la acumulación organo-específica de los fármacos en peces de un rio en España. La detección y, cuando fue posible, la cuantificación, se dirigió a las agallas, bilis, cerebro, corazón, hígado, músculo, páncreas, piel, plasma y riñón de 12 muestras pertenecientes a cuatro especies comunes de la parte baja del río Llobregat, haciendo análisis direccionado específico y análisis de compuestos sospechosos. Adicionalmente, se monitorizó el agua del río en busca de los mismos compuestos.

Mientras que en las muestras de agua se identificaron 53 sustancias por medio de un análisis direccionado y/o suspect screening, en uno o varios órganos de cada especie se detectaron hasta 34 compuestos. La evaluación semicuantitativa indicó la distribución preferencial de los fármacos, las drogas de abuso, los metabolitos y los TPs en el riñón, la piel, el hígado, el cerebro y el páncreas.

In this doctoral thesis, analytical methods for the determination of pharmaceuticals for human use in fish muscle tissue were developed. For detection and quantification of pharmaceuticals, liquid chromatography (LC) coupled to high resolution mass spectrometry (HRMS) using a QTOF instrument in SWATH mode was used. The validated analytical methodologies used QuEChERS extraction or ultrasound extraction. Purification of the extracts was aimed to remove the lipid material, by EMR-lipid removal and Z-Sep+. The validated parameters included recovery, accuracy, matrix effect, reproducibility, sensitivity, robustness and linearity. The validated QuEChERS extraction method performed for freeze-dried fish muscle matrices, at 3 different levels of concentration, was applied to 16 samples collected from two European rivers. The quantitative analysis revealed the presence of seven pharmaceuticals in concentrations up to 80 ng/g dry weight of fish. In the second methodology, samples of fresh fish (fw) were examined for the presence of 47 drugs in targeted mode validated up to 50 ng/g fish (fw). As a complement, more than 500 pharmaceuticals, drugs of abuse, metabolites and transformation products were included for the suspected screening analysis. Positive results were confirmed through HRMS databases: SCIEX All-In-One HR-MS/MS, NIST 2017 library, Chemspider. The application of this method to 32 fish samples from 4 European rivers resulted in the detection of ten pharmaceuticals at concentrations up to 69 ng/g fish (fw). By suspect screening analysis, benzoylecgonine, cocaine, nicotine and ofloxacin were successfully detected and confirmed in the analyzed samples. Additionally, we performed a study of organ-specific accumulation of the pharmaceuticals in fish samples (and water) from the Llobregat River, Spain, using target and suspected screening analysis. The detection / quantification, was directed to tissues, organs and bio- fluids of fish. While 53 substances were identified in the water samples by targeted analysis and/or suspected screening, up to 34 compounds were detected in the organs of each specie. The semi-quantitative evaluation indicated the preferential distribution of pharmaceuticals, drugs of abuse, metabolites and transformation products in the kidney, skin, liver, brain and pancreas.