Estudio de la quasiespecies del virus de la hepatitis B a través de secuenciación masiva para la identificación de dianas terapéuticas y factores pronósticos

Abstract

Tot i tenir una vacuna preventiva eficaç, el virus de l'hepatitis B (VHB) és un greu problema de salut mundial degut a la seva elevada prevalença (afecta a més de 250 milions de persones a tot el món) i a la morbiditat que deriva de la seva cronicitat, ja que és el primer factor virològic de risc en el desenvolupament de carcinoma hepatocel·lular (HCC). La proteïna HBc (codificada pel gen HBC) és imprescindible per al virus. S'autoacobla formant la càpsida viral i gràcies a la seva àmplia xarxa d'interaccions intervé en múltiples processos del cicle viral. Tot i que el tractament disponible actualment permet controlar la replicació viral, avui en dia no és possible erradicar la infecció, de manera que es necessiten noves estratègies terapèutiques. A més, considerant la gravetat de l'evolució clínica de la malaltia, la identificació de factors virològics que poguessin pronosticar la progressió del dany hepàtic seria de gran ajuda en el seguiment dels pacients. En aquest projecte de tesi doctoral s'ha analitzat, a través de seqüenciació massiva, la conservació i la complexitat de la quasiespecies (QS) del VHB a la regió del gen HBC en pacients amb hepatitis crònica B en diferents estats de la malaltia hepàtica. Amb això s'han volgut detectar, tant regions hiperconservades (independentment del quadre clínic o el genotip viral dels pacients) que poguessin servir de possibles dianes per a noves estratègies terapèutiques i/o diagnòstiques com diferències en termes de conservació, mutacions i complexitat de la QS entre els diferents quadres clínics analitzats que poguessin servir de factors pronòstics de l'avanç de la malaltia.

El genoma del VHB es va extreure a partir de mostres de sèrum de pacients amb hepatitis crònica per VHB en diferents etapes clíniques de la malaltia i la regió HBC del genoma viral es va amplificar, a través d'un sistema d'amplificació de tres passos seqüencials, dividit en dos amplicons. Seguidament aquests es van seqüenciar per Next Generation Sequencing (NGS) a través de la plataforma MiSeq Illumina. Un cop fet el genotipatge de la població viral, la presència de mutacions es va detectar alineant les seqüències obtingudes per a cada pacient amb una seqüència consens del genotip corresponent. La conservació de la QS, tant global com per grup, es va analitzar calculant el contingut d'informació. També es van analitzar diversos indicadors de complexitat de la QS.

Es van detectar regions (tant nucleotídiques com aminoacídiques) hiperconservades independentment del quadre clínic i del genotip viral l'elevada conservació de les quals podria evidenciar la seva importància funcional, de manera que podrien ser valuoses dianes de teràpia i diagnosi. A més, es van evidenciar regions conservades específicament en certs grups clínics, el que suggereix un possible paper d'aquestes regions en la progressió de la malaltia hepàtica. En els dos estudis realitzats es va detectar una substitució aminoacídica (P79Q) en els pacients amb lesió tumoral (HCC). En aquests mateixos pacients es va detectar una elevada complexitat de la QS a la regió d'un dels dos amplicons en què es va dividir el gen HBC. L'elevada complexitat de la QS i la detecció de la substitució P79Q en els pacients HCC podrien ser factors pronòstics de la transformació tumoral. Posteriors estudis seran necessaris per analitzar amb més profunditat la possible associació entre aquests factors i la lesió hepàtica.

En resum, els resultats obtinguts podrien servir com a base per al desenvolupament d'estratègies panclíniques i pangenotípiques de tractament i diagnosi de l'hepatitis crònica per VHB, així com per a la identificació de factors pronòstics que puguin ajudar en el seguiment de la malaltia hepàtica.

A pesar de tener una vacuna preventiva eficaz, el virus de la hepatitis B (VHB) es un grave problema de salud mundial debido a su elevada prevalencia (afecta a más de 250 millones de personas en todo el mundo) y a la morbilidad que deriva de su cronicidad, pues es el primer factor virológico de riesgo en el desarrollo de carcinoma hepatocelular (HCC). La proteína HBc (codificada por el gen HBC) es imprescindible para el virus. Se autoensambla formando la cápside viral y gracias a su amplia red de interacciones interviene en múltiples procesos del ciclo viral. Aunque el tratamiento disponible actualmente permite controlar la replicación viral, hoy en día no es posible erradicar la infección, por lo que se necesitan nuevas estrategias terapéuticas. Además, considerando la gravedad de la evolución clínica de la enfermedad, la identificación de factores virológicos que pudieran pronosticar la progresión del daño hepático sería de gran ayuda en el seguimiento de los pacientes. En este proyecto de tesis doctoral se ha analizado, a través de secuenciación masiva, la conservación y la complejidad de la quasiespecies (QS) del VHB en la región del gen HBC en pacientes con hepatitis crónica B en diferentes estados de la enfermedad hepática. Con ello se han querido detectar, tanto regiones hiperconservadas (independientemente del cuadro clínico o el genotipo viral de los pacientes) que pudieran servir de posibles dianas para nuevas estrategias terapéuticas y/o diagnósticas como diferencias en términos de conservación, mutaciones y complejidad de la QS entre los distintos cuadros clínicos analizados que pudieran servir de factores pronósticos del avance de la enfermedad.

El genoma del VHB se extrajo a partir de muestras de suero de pacientes con hepatitis crónica por VHB en diferentes etapas clínicas de la enfermedad y la región HBC del genoma viral se amplificó, a través de un sistema de amplificación de tres pasos secuenciales, dividido en dos amplicones. Seguidamente estos se secuenciaron por Next Generation Sequencing (NGS) a través de la plataforma MiSeq Illumina. Una vez hecho el genotipado de la población viral, la presencia de mutaciones se detectó alineando las secuencias obtenidas para cada paciente con una secuencia consenso del genotipo correspondiente. La conservación de la QS, tanto global como por grupo, se analizó calculando el contenido de información. También se analizaron diversos indicadores de complejidad de la QS.

Se detectaron regiones (tanto nucleotídicas como aminoacídicas) hiperconservadas independientemente del cuadro clínico y del genotipo viral cuya elevada conservación podría evidenciar su importancia funcional, por lo que podrían ser valiosas dianas de terapia y diagnosis. Además, se evidenciaron regiones conservadas específicamente en ciertos grupos clínicos, lo que sugiere un posible rol de estas regiones en la progresión de la enfermedad hepática. En los dos estudios realizados se detectó una sustitución aminoacídica (P79Q) en los pacientes con lesión tumoral (HCC). En estos mismos pacientes se detectó una elevada complejidad de la QS en la región de uno de los dos amplicones en los que se dividió el gen HBC. La elevada complejidad de la QS y la detección de la sustitución P79Q en los pacientes HCC podrían ser factores pronósticos de la transformación tumoral. Posteriores estudios serán necesarios para analizar con más profundidad la posible asociación entre estos factores y la lesión hepática.

En resumen, los resultados obtenidos podrían servir como base para el desarrollo de estrategias panclínicas y pangenotípicas de tratamiento y diagnosis de la hepatitis crónica por VHB, así como para la identificación de factores pronósticos que puedan ayudar en el seguimiento de la enfermedad hepática.

Despite having an effective preventive vaccine, the hepatitis B virus (HBV) is a serious global health problem due to its high prevalence (it affects more than 250 million people worldwide) and the morbidity derived from its chronicity, as it is the first virological risk factor in the development of hepatocellular carcinoma (HCC). The HBc protein (encoded by the HBC gene) is essential for the virus. It self-assembles forming the viral capsid and thanks to its wide network of interactions it intervenes in multiple steps of the viral cycle. Although the present therapeutic protocol allows to adequately control the viral replication, the eradication of the infection is not achievable, for which reason new therapeutic strategies are required. Moreover, considering the severity of the disease progression, the identification of viral prognostic factors could be extremely helpful in patients follow-up. In this doctoral thesis we have analysed, through massive sequencing, the conservation and complexity of the quasispecies (QS) of the HBC gene of HBV in patients with chronic hepatitis B at different clinical stages in order to detect both hyperconserved regions (regardless of the clinical stage or the viral genotype) that could serve as possible targets for new therapy and/or diagnostic strategies, and group-specific differences in terms of conservation, mutations and complexity of the QS that could serve as prognostic factors for the disease progression.

HBV genome was extracted from serum samples of patients with chronic hepatitis B at different clinical stages and the HBC region was amplified, using a three-steps amplification protocol, divided in two amplicons. The amplicons were later sequenced by Next Genetation Sequencing (NGS) using the MiSeq Illumina platform. Once the viral population was genotyped, the presence of mutations was detected by aligning the sequences obtained for each patient with a consensus sequence of the corresponding genotype. QS conservation, both general and group-related, was studied by calculating the information content. QS complexity was analysed by considering different indexes.

We detected some nucleotide and amino acid hyper-conserved regions (regardless of the clinical stage and the viral genotype) that could be used as therapeutic or diagnostic targets. Moreover, some group-specific conservation patterns, that could cover a role in disease progression, were observed. In both studies of the project an amino acid substitution (P79Q) was detected in patients with tumoral injury (HCC). The patients in this clinical stage showed a high QS complexity in one of the HBC amplicons. The P79Q mutation and the high complexity in HCC patients could be used as prognostic factors of tumoral transformation. However, further studies are required to deeply clarify the possible association between these viral factors and the liver injury.

In summary, the results here obtained could serve as a basis for the development of panclinic and pangenotypic strategies for the treatment and diagnosis of chronic hepatitis B as well as for the identification of prognostic factors that could be helpful in liver disease progression follow-up.