Application of omic approaches on the mechanisms of pollutants using Daphnia magna as model species

Abstract

Environmental toxicology is undergoing a paradigm shift due to the new concerning environmental reality. Nowadays, to manage subtler and chronic effects of chemicals, either single or mixtures, is an imperative need, especially at low and environmentally relevant concentrations. Not least important is to deal with emerging contaminants (ECs), whose harmful effects in ecosystems and toxicity mechanisms are still unknown. Therefore, new strategies for assessing the toxicity of pollutants with greater environmental relevance must be developed, what requires the application of integrative approaches combining tools from different disciplines. Omic technologies allow the holistic measurement of effects at low levels of biological organization in high throughput platforms, and provide mechanistic data which may become essential in the development and application of more efficient and effective testing strategies. Overall, this thesis aimed to prove the importance of integrating omic and conventional toxicological approaches in order to obtain significant information that helps to unravel any new toxicity mechanism triggered by ECs on the aquatic environment using Daphnia magna as model species.

The ECs studied included suspected lipid disruptors (endocrine disrupting compounds, EDCs) and ECs that are known to affect the central nervous system (i.e. neuroactive pharmaceuticals and other chemicals). Different integrative approaches have been developed to assess the toxicity of these compounds by linking effects on reproduction and behavior (individual organism responses), with gene expression changes and its subsequent metabolomic (and thus lipidomic) disruption in D. magna. The ability of EDCs and neuroactive pharmaceuticals to affect reproduction and disrupt lipid homeostasis, as well as the molecular signaling pathways that modulate this disruption, has been addressed throughout the thesis. Within the chapter 2, microarray transcriptomic analysis of D. magna adult females exposed to some EDCs during reproduction was performed, together with the effects on their lipidome by a lipidomic analysis using UHPLC-TOF MS. Common transcriptional mechanisms were identified as energy-related categories, molting and reproduction, and different lipid functional

categories. The obtained results allowed to link reproductive effects with changes in lipid profiles and disrupted transference of lipids to eggs in D. magna females. Lipidomic effects of neuroactive pharmaceuticals at environmental concentrations and the driven molecular mechanisms behind them were studied in chapter 3. The hypothesis that serotonin may be involved in regulating lipid dynamics and fecundity responses in D. magna was confirmed by the analysis of the lipidome of genetically tryptophan hydrolase gene knockout clones. Finally, in chapter 4 a targeted metabolomic approached was developed to analyze neurotransmitters in D. magna samples and employed in the study of the effects of neuroactive pharmaceuticals that affected Daphnias’ cognitive behavior. Metabolomic results were linked to the associated transcriptional disruption studied through RNAseq, probing the suitability of these organisms for environmental neurotoxicity studies.

Overall, the results obtained throughout this thesis allowed to link transcriptomic signaling pathways with metabolomic effects (lipidomic and neurotransmitter profiles) and with apical responses (reproduction and behavior).

La toxicología ambiental está experimentando un cambio de paradigma debido a la preocupante nueva realidad medioambiental. Hoy en día, gestionar los efectos más sutiles y crónicos de los compuestos químicos, ya sean individualizados o en mezclas, es una necesidad imperiosa, especialmente en concentraciones bajas y relevantes para el medio ambiente. No menos importante es ocuparse de los contaminantes emergentes (EC), cuyos efectos nocivos en los ecosistemas y sus mecanismos de toxicidad aún se desconocen. Por lo tanto, deben elaborarse nuevas estrategias con mayor relevancia ambiental para evaluar la toxicidad de los contaminantes, lo que requiere la aplicación de enfoques integradores que combinen herramientas de distintas disciplinas. Las tecnologías ómicas permiten medidas holística de efectos producidos a bajos niveles de organización biológica en plataformas de alto rendimiento, y proporcionan datos mecanicistas que pueden resultar esenciales para el desarrollo y la aplicación de estrategias de ensayo más eficientes y eficaces. En general, el objetivo de esta tesis ha sido demostrar la importancia de integrar enfoques toxicológicos ómicos con ensayos toxicológicos convencionales a fin de obtener información significativa que ayude a desentrañar cualquier nuevo mecanismo de toxicidad desencadenado por ECs en el medio acuático utilizando Daphnia magna como especie modelo.

Los contaminantes estudiados en esta tesis incluyeron aquellos sospechosos de ser disruptores de lípidos (compuestos disruptores endocrinos, EDC) y ECs que se sabe que afectan al sistema nervioso central (es decir, fármacos neuroactivos y otros productos químicos). Se han desarrollado diferentes enfoques integradores para evaluar la toxicidad de estos compuestos vinculando los efectos sobre la reproducción y el comportamiento (respuestas individuales del organismo), con los cambios en la expresión de los genes y su posterior alteración metabolómica (y por tanto lipidómica) en D. magna. A lo largo de esta tesis se ha abordado la capacidad de los EDCs y de los fármacos neuroactivos de afectar a la reproducción y perturbar la homeostasis lipídica, así como a las vías de señalización molecular que modulan esta perturbación. En el capítulo 2, se realizó un análisis transcriptómico mediante microarrays de hembras adultas de D. magna expuestas a algunos EDCs durante su etapa reporductora, y se estudiaron los efectos producidos en su lipidoma mediante un análisis lipidómico utilizando UHPLC-TOF MS. Se identificaron mecanismos transcripcionales comunes descritos con categorías funcionales relacionadas con la

energía, la muda y la reproducción, así como diferentes categorías funcionales de lípidos. Los resultados obtenidos permitieron vincular los efectos reproductivos con cambios en los perfiles de lípidos, así como con una alterada transferencia de lípidos de las hembras de D. magna a sus huevos. En el capítulo 3 se estudiaron los efectos lipidómicos de productos farmacéuticos neuroactivos en concentraciones ambientalmente relevantes y los mecanismos moleculares asociados a ellos. La hipótesis de que la serotonina puede participar en la regulación de la dinámica de los lípidos y las respuestas de la fecundidad en D. magna se confirmó mediante el análisis del lipidoma de clones con el gen triptófano hidrolasa silenciado. Por último, en el capítulo 4 se desarrolló un enfoque metabolómico dirigido para analizar neurotransmisores en D. magna y se empleó en el estudio de los efectos de fármacos neuroactivos que afectaban a su comportamiento cognitivo. Los resultados metabólicos se vincularon a la alteración transcripcional asociada estudiada a través del RNAseq, probando la idoneidad de estos organismos para estudios de neurotoxicidad ambiental.

En general, los resultados obtenidos a lo largo de esta tesis permitieron vincular las vías de señalización transcriptómica con efectos metabolómicos (perfiles lipidómicos y de neurotransmisores) y con respuestas apicales (reproducción y comportamiento).