Nous paradigmes de la contribució paterna al desenvolupament embrionari primerenc mitjançant l’anàlisi de l’espermatozoide humà amb tècniques d'alt rendiment

Abstract

L’aplicació de tècniques d’alt rendiment, com la transcriptòmica i la proteòmica, en l’estudi de l’espermatozoide humà, ha permès obtenir grans avenços en la coneixença de la seva composició i funció normal, així com d’algunes alteracions associades a la infertilitat. A més, s’ha demostrat en els últims anys, que l’espermatozoide, a part d’aportar a l’embrió el DNA amb marques epigenètiques, també aporta una complexa població de proteïnes i RNAs, algunes d’elles crucials per la fertilització i el l’embriogènesi. Tot i així, encara manquen estudis per determinar l’impacte de la participació paterna a l’embrió en desenvolupament. L’estudi de pacients normozoospèrmics amb infertilitat d’origen desconegut és clau, ja que no presenten defectes en l’espermatogènesi i permet determinar, caracteritzar i analitzar la correcta contribució de la cèl·lula espermàtica al zigot i identificar potencials alteracions. En aquesta mateixa línia, es poden distingir dos tipus d’aproximacions quan s’utilitzen tècniques d’alt rendiment: els estudis descriptius amb inferència in silico i els estudis comparatius.

S’ha proposat que el contingut d’RNAs de l’espermatozoide contribueixen al desenvolupament embrionari primerenc, sobretot els RNAs no codificants que regulen l’expressió gènica. Recentment, s’ha descrit un nou tipus d’RNA no codificant en altres tipus cel·lulars, els RNAs circulars (circRNAs), que regulen l’expressió gènica tan a nivell transcripcional com posttranscripcional. L’espermatozoide és una cèl·lula molt especial i diferenciada: no transcriu ni tradueix, presenta una estructura de la cromatina molt particular i posseeix una població abundant, complexa i estable d’RNAs tan codificants com no codificants. El fet que els circRNAs presenten vides mitjanes llargues i poden regular l’expressió gènica, suggereix que l’espermatozoide podria tenir una població única de circRNAs. De fet, degut a que els circRNAs no presenten extrem 3’, es podrien estar protegint a ells mateixos o a altres RNAs no codificants de la degradació durant el trànsit pel tracte sexual masculí i femení i, per tant, podrien ser claus per la contribució paterna al desenvolupament embrionari primerenc.

Per altra banda, també s’ha descrit el rol en el desenvolupament embrionari de les PTMs de les histones que empaqueten d’un 5 – 15 % del DNA patern. Tot i així, les protamines, que empaqueten de forma majoritària el genoma de l’espermatozoide (85 – 95 %), i les seves potencials PTMs han estat poc explorades. Per tant, podria ser que existís un codi de PTMs de les protamines com el que existeix amb les histones que podria contribuir a l’embriogènesi. En els pacients normozoospèrmics amb infertilitat d’origen desconegut, la predicció de la taxa d’èxit de les TRAs i la contribució de l’espermatozoide a la qualitat embrionària ha estat poc explorat. A nivell proteic, s’ha determinat la contribució de l’espermatozoide en embrions que provenen de IIA o FIV convencional i s’han relacionat defectes espermàtics associats amb la capacitació i la fertilització que podrien ser la causa latent de la infertilitat en aquests casos. Per contra, pocs estudis han relacionat la qualitat embrionària després de FIV-ICSI en individus normozoospèrmics amb infertilitat d’origen desconegut. Es creu que l’espermatozoide té un paper fonamental durant els primers estadis del desenvolupament embrionari primerenc, abans de l’activació del genoma que té lloc entre els dies 2 i 3 entre l’estadi de 4 – 8 cèl·lules. Per aquest motiu, manquen estudis que valorin la qualitat embrionària en dia 2 d’embrions provinents d’individus normozoospèrmics amb infertilitat d’origen desconegut després de FIV-ICSI per poder determinar la possible contribució paterna a l’embriogènesi i poder predir la taxa d’èxit de les TRA.

Per tant, la hipòtesi d’aquesta Tesi Doctoral és que la combinació tan d’estudis descriptius amb inferència in silico com comparatius a diferents nivells moleculars de l’espermatozoide humà permetrà augmentar la comprensió de la contribució paterna a l’embrió. Per aquest motiu, s’espera que en individus normozoospèrmics amb infertilitat d’origen desconegut, la descripció de la població de circRNAs i de les PTMs presents a les protamines de l’espermatozoide humà, així com la comparació d’alteracions en el conjunt de proteïnes de l’espermatozoide que afectin a la qualitat embrionària, permetrà aclarir la normalitat i les alteracions de la contribució paterna en la fertilització i les primeres etapes del desenvolupament embrionari.

The classical idea about the function of spermatozoa during fertilization was limited to the transport of the paternal haploid genome to the mature oocyte. However, in the last few years, the application of high-throughput techniques in the study of male fertility has revealed that spermatozoa also contribute during the fertilization with other components, such as epigenetic marks, RNAs and proteins, some of them with potential roles in the early embryo development. The application of high-throughput techniques in the study of male infertility, specifically in those patients who show a normal seminogram, might increase the knowledge of the paternal contribution to the embryo. Therefore, in this doctoral thesis, we have applied two different approaches using high-throughput techniques: proteomic and transcriptomic descriptive studies with in-silico inference of the paternal RNAs and proteins potential functions in the early stages of embryogenesis and a comparative proteomic study between normozospermic infertile patients classified according to the embryo quality at day 2. The results of the descriptive studies at different molecular levels have determined that during fertilization, the spermatozoa provides to the oocyte a complex and unique population of circular RNAs (circRNAs), including exonic and intronic circRNAs, some of which exclusively delivered by the paternal lineage during fertilization with potential roles in the regulation of gene expression in the early stages of embryo development. Furthermore, protamines, which tightly pack most of the paternal DNA, contain multiple posttranslational modifications (PTMs) that might be associated with potential epigenetic roles and could play a role in the zygote. The comparative study evaluating embryonic quality on day 2 of embryogenesis has contributed to characterize a set of crucial proteins related to embryonic quality, and thus to embryogenesis, as well as some potential biomarkers for the different assisted reproduction techniques success rate prediction. In conclusion, the results derived from this doctoral thesis has demonstrated that the combination using high-throughput techniques of descriptive studies with in-silico inference and comparative studies provides complementary information useful towards determination of the impact of the sperm cell to the early embryo development and beyond.