Origen y evolución de los genes que confieren resistencia clínica a sulfamidas y a trimetoprim

Abstract

La resistència als compostos antibacterians és un greu problema a la sanitat moderna, tant humana com animal. Està ampliament demostrat que la resistència als antibiòtics va sorgir fa milions d’anys a bacteris productors d’aquests compostos o als seus competidors. No obstant això, la resistència als agents quimioterapèutics no es pot explicar pel mateix mecanisme, ja que no són produïts de forma natural. Per tant, clàssicament s’ha assumit que la resistència a aquest tipus de compostos va emergir i va evolucionar ràpidament a partir de la seva aplicación a la teràpia antibacteriana. La resistència clínica a les sulfamides i al trimetoprim es deu principalment a la presència dels gens mòbils sul i dfr, respectivament. Aquests gens codifiquen versions alternatives i funcionals dels enzims dihidropteroat sintasa i dihidrofolat reductasa que no són inhibits per l’acció d’aquests antibacterians, a diferència dels gens bacterians folP i folA que codifiquen les variants cromosòmiques d’aquests enzims i que són típicament sensibles als citats agents antibacterians.

L’objectiu central de la present Tesis Doctoral ha estat la identificació de l’origen dels gens que confereixen resistència clínica a les sulfamides i al trimetoprim, així com l’anàlisis del procés evolutiu que ha donat lloc a les variants enzimàtiques actuals.

Així, s’han analitzat les seqüències dels gens sul i el seu entorn amb l’objectiu de detectar elements que permetessin l’elucidació del seu origen. Com a conseqüència d’aquesta anàlisi, s’ha identificat un motiu Sul present a les seqüències de les proteïnes codificades pels gens mòbils sul1, sul2 i sul3, que confereixen resistència a les sulfamides, així com la associació física a múltiples plasmidis del gen sul2 amb un fragment del gen glmM que codifica una fosfoglucomutasa. L’estudi comparatiu des les seqüències dels gens folP cromosòmics de tot el domini Bacteria ha permet identificar la presencia del motiu Sul a les proteïnes codificades pels gens folP de dues famílies bacterianes: Rhodobiaceae i Leptospiraceae. L’estudi filogenètic de les proteïnes FolP/Sul i GlmM ha establert clarament que els gens sul1-2 i sul3 es van originar mitjançant sengles processos de mobilització independents dels gens folP cromosòmics presents, respectivament, a Rhodobiaceae i Leptospiraceae. Tanmateix, els experiments in vitro han revelat que els gens folP codificats a Rhodobiaceae i Leptospiraceae confereixen resistència a les sulfamides. Aquests resultats indiquen que la resistència a les sulfamides és ancestral i anterior a la introducció clínica d’aquest agent antibcterià.

D’altra banda, es va analitzar l’origen i la evolució dels gens mòbils dfrA que confereixen resistència al trimetoprim. Al contrari del que s’ha descrit pels gens sul, els resultats obtinguts de l’anàlisis de les seqüències dels gens dfrA mòbils indiquen que aquests s’han originat mitjançant events múltiples de transferència lateral de gens folA cromosòmics. Així mateix, s’ha pogut establir que la majoria dels gens cromosòmics folA predecessors dels dfrA també confereixen resistència al trimetoprim. Tot això revela que la resistència al trimetoprim determinada per elements mòbils es pot explicar per dos processos independents i complementaris: i) la captació de gens folA cromosòmics, portadors d’una mutación ancestral responsable d’aquesta resistència i que es va originar en absència del quimitoeràpic, i ii) la transferència de mutants espontanis cromosòmics del gen folA, presents a una població bacteriana coetània amb l’exposició al citat antibacterià, i havent estat seleccionats per aquesta exposició.

La resistencia a los compuestos antibacterianos es un grave problema en la sanidad moderna, tanto humana como animal. Está ampliamente demostrado que la resistencia a los antibióticos surgió hace millones de años en bacterias productoras de estos compuestos o en sus competidoras. No obstante, la resistencia a los agentes antibacterianos sintéticos no se puede explicar por el mismo mecanismo, ya que no se producen de forma natural. Por consiguiente, se ha asumido que la resistencia a este tipo de compuestos emergió y ha evolucionado rápidamente a partir de su aplicación en la terapia antibacteriana. La resistencia clínica a las sulfamidas y al trimetoprim se debe principalmente a la presencia de los genes móviles sul y dfr, respectivamente. Estos genes codifican versiones alternativas y funcionales de las enzimas dihidropteroato sintasa y dihidrofolato reductasa que no son inhibidas por la acción de estos antibacterianos, a diferencia de los genes bacterianos folP y folA que codifican las variantes cromosómicas de estos enzimas, típicamente sensibles a los citados agentes quimioterapéuticos.

El objetivo central de la presente Tesis Doctoral ha sido la identificación del origen de los genes que confieren resistencia clínica a las sulfamidas y al trimetoprim, así como el análisis del proceso evolutivo que ha dado lugar a las actuales variantes enzimáticas.

Para ello, se han analizado las secuencias de los genes sul y su entorno para detectar elementos que permitiesen la elucidación de su origen. De este modo, se ha identificado un motivo Sul presente en las secuencias de las proteínas codificadas por los genes móviles sul1, sul2 y sul3, que confieren resistencia a las sulfamidas, así como la asociación física en múltiples plásmidos del gen sul2 con un fragmento del gen glmM que codifica una fosfoglucomutasa. El estudio comparativo de las secuencias de los genes folP cromosómicos de todo el dominio Bacteria ha permitido identificar la presencia del motivo Sul en las proteínas codificadas en los genes folP de dos familias bacterianas: Rhodobiaceae y Leptospiraceae. El análisis filogenético de las proteínas FolP/Sul y GlmM ha establecido claramente que los genes sul1-2 y sul3 se originaron mediante sendos procesos de movilización independientes de los genes folP cromosómicos presentes, respectivamente, en Rhodobiaceae y Leptospiraceae. Asimismo, los ensayos in vitro han revelado que los genes folP codificados en Rhodobiaceae y en Leptospiraceae confieren resistencia a sulfamidas. Estos resultados indican que la resistencia a las sulfamidas es ancestral y anterior a la introducción clínica de este antibacteriano.

Por otro lado, se analizó el origen y evolución de los genes móviles dfrA que confieren resistencia al trimetoprim. Al contrario de lo descrito para los genes sul, los resultados obtenidos en el análisis de las secuencias existentes de genes dfrA móviles indican que éstos se han originado mediante múltiples eventos de transferencia lateral de genes folA cromosómicos. Asimismo, se ha podido establecer que muchos de los genes cromosómicos folA predecesores de los dfrA también confieren resistencia a trimetoprim. Todo ello revela que la resistencia a trimetroprim determinada por elementos móviles se puede explicar por dos procesos independientes y complementarios: i) la captación de genes folA cromosómicos movilizados, portadores de una mutación ancestral responsable de dicha resistencia originada en ausencia del quimioterápico, y ii) la transferencia de genes mutantes espontáneos folA cromosómicos, presentes en una población bacteriana coetánea con la exposición al citado antibacteriano, y habiendo sido seleccionados por dicha exposición.

Antibacterial resistance is a pressing problem in human and animal modern healthcare. It is widely accepted that antibiotic resistance originated million years ago in either the microbes that naturally produce the antibiotics or their competitors. However, resistance to synthetic chemotherapeutic agents cannot be explained by this mechanism, since these drugs are not naturally produced. Resistance to chemotherapeutic compounds is hence assumed to have emerged and evolved rapidly following the clinical introduction of these compounds. Resistance to sulfonamides and trimethoprim is mediated by mobile sul and dfr genes, respectively. These genes encode resistant variants of the di-hydro-pteroate synthase and di-hydrofolate reductase enzymes, in contrast to chromosomal folP and folA genes encoding variants sensitive to these agents.

The overall objective of this Doctoral Thesis is the identification of the chromosomal origin of genes conferring clinical resistance to sulfonamides and trimethoprim, and the study of the evolutionary processes governing their emergence and dissemination.

In this work, sul genes and their genetic neighborhoods have been analyzed to uncover elements that enable the elucidation of their genetic origin. This analysis has led to the identification of a Sul motif associated with sul-encoded proteins, as well as the observation of a consistent genomic association of the sul2 gene with a phosphoglucosamine mutase gene (glmM) . The study of chromosomal folP genes across the Bacteria domain revealed the presence of the Sul motif in the chromosomal folP genes of two families: the Rhodobiaceae and the Leptospiraceae. Phylogenetic analysis of FolP/Sul and GlmM proteins established that the sul1-2 and sul3 genes originated through the independent mobilization of chromosomal folP genes encoded by the Rhodobiaceae and the Leptospiraceae, respectively. In vitro experiments revealed that both the Rhodobiaceae and the Leptospiraceae chromosomal folP genes confer resistance to sulfonamides. These results suggest that resistance to sulfonamides is ancient and predates the clinical introduction of these drugs.

Likewise, the origin and evolution of mobile dfrA genes conferring clinical resistance to trimethoprim have been analysed. The results have shown that, in contrast to sul genes, the dfrA gene arose from multiple mobilization events from chromosomal folA. Furthermore, it has been established that most chromosomal folA genes that are predecessors of mobile dfrA genes also confer trimethoprim resistance. Taken together, these results indicate that the resistance to trimethoprim determined by mobile elements can be explained by two independent and complementary processes: i) the mobilization of chromosomal folA genes carrying an ancestral mutation originated in the absence of trimethoprim and responsible for trimethoprim resistance, and ii) the mobilization of spontaneous mutants in chromosomal folA genes, present in a bacterial population coetaneous with the exposure to trimethoprim, and having been selected by that exposure.

Given the absence of sulfonamides and trimethoprim in nature, these results provide a new perspective on the emergence and dissemination of resistance to new-generation chemotherapeutic agents. Thus, this work concludes that resistant genes may exist in the vast bacterial pangenome and can be selected for and mobilized upon exposure to these new drugs.