Contribution of marine heterotrophic cultured bacteria to microbial diversity and mercury detoxification

Abstract

Els oceans conten aproximadament un total de 10^29 cèl·lules microbianes. Els bacteris marins són responsables de la major part de la respiració que es produeix en l’oceà i són essencials en els cicles biogeoquímics de la Terra. Estudiar la diversitat bacteriana dels ecosistemes marins i tenir accés als genomes mitjançant estudis dependents o independents de cultiu és important per desxifrar el potencial metabòlic dels bacteris marins. El cultius ens aporten informació sobre la fisiologia bacteriana, ecologia i contingut genòmic, però la majoria dels esforços en aïllar bacteris marins provenen de la zona fòtica de l’oceà, deixant les profunditats marines menys explorades. En aquesta tesi, tècniques estàndard de cultiu han permès crear una col·lecció marina de cultius de bacteris heterotròfics (MARINHET), composada per més de 2000 aïllats, recuperats de diverses regions oceanogràfiques, de diverses profunditats (superfície, mesopelàgic i batipelàgic) i cobrint diverses estacions i anys. El Capítol 1 descriu la seva taxonomia, diversitat filogenètica i biogeografia i revela que un 37% de les soques aïllades són 100% idèntiques en el gen ribosomal 16S (16S rRNA) entre la zona fòtica (superfície) i afòtica (mesopelàgic i batipelàgic). A més, hem identificat Alteromonas i Erythrobacter entre els gèneres marins heterotròfics més comuns que recuperem en cultiu usant un medi marí estàndard. Les tècniques tradicionals de cultiu generalment només recuperen una fracció petita de les comunitats bacterianes naturals, fenomen conegut com ‘la gran anomalia de recompte en placa’ i moltes de les soques que s’aïllen pertanyen a la biosfera rara. Tanmateix, no coneixem si aquests patrons, normalment descrits per als bacteris de la zona fòtica, també s’apliquen als bacteris de les profunditats. En el Capítol 2 he combinat els resultats obtinguts mitjançant tècniques dependents i independents de cultiu comparant les seqüències del 16S rRNA de la col·lecció MARINHET contra fragments de seqüenciació massiva del 16S rRNA, tant d’amplicons com de metagenomes, obtinguts de mostres globalment distribuïdes i de diferents profunditats. Trobem que una major proporció dels bacteris de l’oceà profund són cultivables i una fracció important dels aïllats té preferència a un estil de vida adherit a partícules. A més, confirmem que el dogma ‘menys de l’1% dels bacteris són cultivables’ ha de ser revisat ja que trobem variabilitat en les mostres de l’oceà profund, on fins a un 3% de les cèl·lules han sigut cultivades. Els aïllats bacterians són un excel·lent material per a aplicacions biotecnològiques com la bioremediació de zones marines contaminades. El mercuri és un metall pesat tòxic i la seva forma més perillosa, el metilmercuri (MeHg), es bioacumula a la cadena tròfica marina. No obstant això, es coneix molt poc la tolerància de bacteris marins enfront del mercuri o la fisiologia d’aquelles soques que codifiquen l’operó dels gens de resistència (operó mer). El Capítol 3 descriu els resultats del mapeig funcional dels gens merA i merB, clau en la detoxificació, en una fracció de la col·lecció MARINHET. Ens centrem en dos generes marins, amb un potencial genètic per a la degradació del mercuri conegut, com són Alteromonas i Marinobacter. Revelem que els gens merAB estan àmpliament distribuïts en diferents regions oceanogràfiques i en diverses profunditats. Addicionalment, hem seleccionat una soca d’ Alteromonas mediterranea per a futurs estudis de bioremediació degut a la seva alta tolerància i capacitat de degradació de diferents formes de mercuri.

Los océanos contienen aproximadamente un total de 10^29 células microbianas. Las bacterias marinas son responsables de la mayor parte de la respiración que se produce en el océano y son esenciales en los ciclos biogeoquímicos de la Tierra. Estudiar la diversidad bacteriana de los ecosistemas marinos y tener acceso a los genomas mediante estudios dependientes e independientes de cultivo es importante para descifrar el potencial metabólico de las bacterias marinas. Los cultivos nos aportan información sobre la fisiología bacteriana, ecología y contenido genómico, pero la mayoría de los esfuerzos en aislar bacteria marinas provienen de la zona fótica del océano, dejando las profundidades marinas menos exploradas. En esta tesis, técnicas estándar de cultivo han permitido crear una colección marina de bacterias heterótrofas (MARINHET), compuesta por más de 2000 aislados, recuperados de varias regiones oceanográficas, de varias profundidades (superficie, mesopelágico y batipelágico), y cubriendo varias estaciones y años. El Capítulo 1 describe su taxonomía, diversidad filogenética y biogeografía y revela que un 37% de las cepas son 100% idénticas en la secuencia parcial del gen ribosomal 16S (16S rRNA) entre la zona fótica (superficie) y afótica (mesopelágico y batipelágico). Además, hemos identificado Alteromonas y Erythrobacter entre los géneros marinos heterótrofos más comunes que recuperamos en cultivo usando un medio marino estándar. Las técnicas tradicionales de cultivo generalmente solo recuperan una fracción pequeña de las comunidades bacterianas naturales, fenómeno conocido como ‘la gran anomalía de recuento en placa’ y muchas de las cepas que se aíslan pertenecen a la biosfera rara. Sin embargo, no conocemos si estos patrones, normalmente descritos para las bacterias de superficie, también se aplican en las profundidades. En el Capítulo 2 he combinado resultados obtenidos mediante técnicas dependientes e independientes de cultivo comparando las secuencias del 16S rRNA de la colección MARINHET contra los fragmentos de secuenciación masiva del 16S rRNA (de amplicones y metagenomas), obtenidos de muestras globalmente distribuidas y de diferentes profundidades. Una mayor proporción de las bacterias del océano profundo son cultivables y una fracción importante de los aislados tiene preferencia a un estilo de vida adherido a partículas. Además, confirmamos que el dogma ‘menos del 1% de las bacterias son cultivables’ deber ser revisado ya que encontramos variabilidad en las muestras de profundidad, donde hasta un 3% de las células se han podido aislar. Los aislados bacterianos son un excelente material para aplicaciones biotecnológicas, como la biorremediación de zonas marinas contaminadas. El mercurio es un metal pesado tóxico y su forma más peligrosa, el metilmercurio (MeHg), se bioacumula en la cadena trófica marina. No obstante, se conoce muy poco la tolerancia de bacterias marinas frente al mercurio o la fisiológia de aquellas cepas que codifican los genes de resistencia (operón mer). El Capítulo 3 describe los resultados del mapeo funcional de los genes merA y merB, clave en la detoxificación, en una fracción de la colección MARINHET. Nos centramos en dos géneros marinos, con un potencial genético para la degradación del mercurio previamente descrito en la literatura, como son Alteromonas y Marinobacter. Desvelamos que los genes merAB están ampliamente distribuidos en diferentes regiones oceanográficas y en varias profundidades. Adicionalmente, hemos seleccionado una cepa de Alteromonas mediterranea para futuros estudios de biorremediación debido a su alta tolerancia y capacidad de degradación de diferentes formas de mercurio.

The world’s oceans sustain the life for an estimated total of 10^29 microbial cells. Marine bacteria are responsible for most part of the ocean respiration and are key in most biogeochemical cycles of the Earth. Accordingly, the study of the bacterial diversity present in different marine ecosystems is essential, and having access to their genomes through isolation or genomic centric studies is important to decipher their metabolic potential. Isolation of marine microorganisms is fundamental to gather information about their physiology, ecology and genomic content. To date, most of the bacterial isolation efforts have focused on the photic ocean leaving the deep ocean less explored. In this thesis, standard plating techniques allowed to create a marine culture collection of heterotrophic bacteria (MARINHET). More than 2000 isolates were retrieved from samples collected from a variety of oceanographic regions, from different depths including surface, mesopelagic and bathypelagic waters, and also covering different seasons and years. Chapter 1 describes the taxonomy, the phylogenetic diversity and the biogeography of culturable heterotrophic marine bacteria, and reveals that an important percentage of the strains (37%) are 100% identical in their partial 16S rRNA gene between photic and aphotic layers. In addition, we identified Alteromonas and Erythrobacter genera as the most frequently retrieved heterotrophic bacteria from the ocean in standard marine agar medium. It is a long-standing observation that traditional culture techniques only retrieve a small fraction of the microbial diversity found in natural environments including marine ecosystems, what is known as ‘the great plate count anomaly’. In addition, most of the retrieved isolates belong to the so-called rare biosphere. However, we do not know if these patterns, usually described for bacteria living in the photic ocean, also apply for the deep ocean bacteria. In Chapter 2 of this thesis, I combined results from culture-dependent and -independent techniques by comparing the 16S rRNA partial sequences of the MARINHET isolates with 16S rRNA amplicon Illumina TAGs (16S iTAGs) and metagenomic TAGs (miTAGs) from surface, mesopelagic and bathypelagic samples globally distributed. A high proportion of bacteria inhabiting the deep ocean could be retrieved by pure culture techniques and a significant fraction of the isolates preferred a lifestyle attached to particles. Additionally, I revised the axiom that ‘less than 1% of bacteria can be cultured’, finding variability between mesopelagic and bathypelagic samples, where up to 3% of the cells could be cultured. Bacterial isolates also represent a valuable genetic reservoir for biotechnology applications, such as bioremediation strategies of marine polluted environments. Mercury is one of the most toxic heavy metals in the planet and its most dangerous form, methylmercury (MeHg), is being bioaccumulated in the marine food web. However, little is known about the tolerance capacity and phenotypic characterization of marine bacteria codifying the mercury resistance operon (mer operon). Chapter 3 describes the functional screening of merA and merB genes, which are key in the mercury detoxification process, in well know marine genera with described genetic potential for mercury detoxification, such as Alteromonas and Marinobacter. I reported that the merAB genes from these two genera are widely distributed in different oceanographic regions and depths. In addition, I selected a promising candidate, phylogenetically affiliated to Alteromonas mediterranea, for future bioremediation studies due to its high tolerance and degradation ability of different mercury forms.