Photosensitive Targeted Nanocarriers for Selective Delivery of Photodynamic Therapy

Abstract

Aquesta tesi aprofundeix en l’estudi de nanotransportadors de vehiculització activa com sistemes de distribució de fàrmacs per a teràpia fotodinàmica contra el càncer. Dos tipus de nanovehicles de diferent naturalesa s’han fet servir: nanopartícules de poli-(D,L-làctid-co-glicòlid) (PLGA) i nanopartícules mesoporoses de sílice (MSNPs). La vehiculització de fàrmacs mitjançant sistemes de nanotransport pot superar certes limitacions que experimenta el subministrament de fàrmacs convencional, com per exemple, augmentar la seva selectivitat. En relació a aquest últim aspecte, el major inconvenient que presenta qualsevol teràpia contra el càncer és la dificultat de controlar amb precisió la localització del fàrmac en el teixit tumoral i no en un de sà. Per millorar això, l’administració de fàrmacs mitjançant nanotransportadors permet la seva vectorització activa a cèl·lules tumorals gràcies a la decoració del nanosistema amb lligands dirigits a reconèixer i unir-se a receptors de la superfície cel·lular sobreexpressats en aquestes cèl·lules. En aquesta tesi, s’han explorat dos tipus de lligands vectoritzats: el pèptid c(RGDfK) i l’anticòs Cetuximab. Primer, s’han desenvolupat nanopartícules de PLGA amb el fotosensibilitzador ZnTriMPyP unit covalentment i decorades amb el pèptid c(RGDfK). S’ha avaluat les seves propietats fisicoquímiques i fotofísiques, així com la seva activitat fototóxica. La unió covalent del compost hidrofílic ZnTriMPyP a la superfície de nanopartícules de PLGA-PEG millora la fototoxicitat i toxicitat a les fosques del nanosistema en comparació amb altres nanotransportadors similars amb el fotosensibilitzador oclòs. La conjugació del pèptid c(RGDfK) millora l’acció fotodinàmica contra cèl·lules tumorals que expressen el receptor de integrina v3; però no evita el dany a cèl·lules sense aquesta integrina. En segon lloc, s’ha explorat el disseny d’immuno-foto-nanotransportadors. Per això s’han sintetitzat MSNPs decorades amb ftalocianina i Cetuximab. S’ha estudiat les seves propietats fisicoquímiques, fotofísiques i fotobiològiques. D’entrada, les nanopartícules s’han preparat amb la ftalocianina ZnPcSMP, però aquesta està fortament agregada i la seva capacitat per produir oxigen singlet es veu disminuïda quan està unida covalentment a MSNPs. D’altre banda, la ftalocianina IRDye700DX manté la seva habilitat per produir oxigen singlet i, per tant, el nanotransportador aconsegueix acció fotodinàmica en cèl·lules. A més, la unió del Cetuximab millora la dispersió de les nanopartícules en aigua, permetent la seva internalització cel·lular segons el grau d’expressió d’EGFR. Per últim, s’han desenvolupat quimio-immuno-foto-nanotransportadors. S’han dissenyat MSNPs decorades amb ftalocianina, Cetuximab i Doxorrubicina per permetre l’alliberament a demanda de l’agent quimioterapèutic provocat per l’oxigen singlet. Aquest nanosistema ha sigut caracteritzant segons les seves propietats fisicoquímiques i fotofísiques i, així mateix, s’ha avaluat la seva fototoxicitat cel·lular. La unió de petites quantitats de Doxorrubicina a la nanopartícula provoca una reducció de la seva capacitat de producció d’oxigen singlet i activitat fotodinàmica. Contràriament, amb majors concentracions de Doxorrubicina, el nanotransportador mostra fototoxicitat eficient i selectiva contra cèl·lules que expressen EGFR, principalment per acció de la Doxorrubicina alliberada mitjançant la ruptura de la seva cadena d’unió per oxigen singlet.

Esta tesis profundiza en el estudio de nanotransportadores de vehiculización activa como sistemas de distribución de fármacos para terapia fotodinámica contra el cáncer. Se han empleado dos tipos de nanovehículos de diferente naturaleza: nanopartículas de poli-(D,L-láctido-co-glicólido) (PLGA) y nanopartículas mesoporosas de sílice (MSNPs). La vehiculización de fármacos mediante sistemas de nanotransporte puede superar ciertas limitaciones que experimenta el suministro de fármacos convencional, como por ejemplo aumentar su selectividad. En relación a esto último, el mayor inconveniente que presenta cualquier terapia contra el cáncer radica en la dificultad de controlar con precisión la localización del fármaco en el tejido tumoral y no en uno sano. Para mejorar esto, la administración de fármacos mediante nanotransportadores permite su vectorización activa a células tumorales gracias a la decoración del nanosistema con ligandos dirigidos a reconocer y unirse a receptores de la superficie celular sobreexpresados en estas células. En esta tesis, se han explorado dos tipos de ligandos vectorizados: el péptido c(RGDfK) y el anticuerpo Cetuximab. Primero, se han desarrollado nanopartículas de PLGA con el fotosensibilizador ZnTriMPyP unido covalentemente y decoradas con el péptido c(RGDfK). Se han evaluado sus propiedades fisicoquímicas y fotofísicas, al igual que su actividad fototóxica. La unión covalente del compuesto hidrofílico ZnTriMPyP a la superficie de nanopartículas de PLGA-PEG mejora la fototoxicidad y toxicidad a oscuras del nanosistema en comparación con nanotransportadores similares con el fotosensibilizador ocluido. La conjugación del péptido c(RGDfK) mejora la acción fotodinámica contra células tumorales que expresan el receptor de integrina v3; pero no evita el daño a células sin dicha integrina. En segundo lugar, se ha explorado el diseño de inmuno-foto-nanotransportadores. Para esto se han sintetizado PEG-MSNPs decoradas con ftalocianina y Cetuximab. Se han estudiado sus propiedades fisicoquímicas, fotofísicas y fotobiológicas. De entrada, las nanopartículas se han preparado con la ftalocianina ZnPcSMP, no obstante, ésta está fuertemente agregada y su habilidad para producir oxígeno singlete se ve disminuida cuando está unida covalentemente a MSNPs. Por otro lado, la ftalocianina IRDye700DX mantiene su habilidad para generar oxígeno singlete y, por ende, el nanotransportador consigue acción fotodinámica en células. Además, la unión del Cetuximab mejora la dispersión de las nanopartículas en agua, permitiendo su internalización celular según el grado de expresión de EGFR. Por último, se han desarrollado quimio-inmuno-foto-nanotransportadores. Se han diseñado MSNPs decoradas con ftalocianina, Cetuximab y Doxorrubicina para permitir la liberación a demanda del agente quimioterapéutico provocado por el oxígeno singlete. Este nanosistema ha sido caracterizado según sus propiedades fisicoquímicas y fotofísicas, al igual que se ha evaluado su fototoxicidad celular. La unión de pequeñas cantidades de Doxorrubicina a la nanopartícula provoca una reducción en su capacidad de producción de oxígeno singlete y actividad fotodinámica. En cambio, con mayores concentraciones de Doxorrubicina, el nanotransportador muestra fototoxicidad eficiente y selectiva contra células que expresan EGFR, principalmente por acción de la Doxorrubicina liberada mediante la rotura de su cadena de unión por oxígeno singlete.

This thesis reports the study of active-targeting nanocarriers as drug delivery systems for photodynamic therapy for cancer purposes. Poly‐(D,L‐lactide‐co‐glycolide) (PLGA) nanoparticles and mesoporous silica nanoparticles (MSNPs) are the two nanovehicles of different nature employed. The vehiculization of drugs through nanodelivery systems can overcome limitations that conventional delivery experiences, such as increasing its selectivity. In this regard, the major limitation of any cancer therapy lies on the difficulty to precisely control the localization of the drug in the tumor tissue and not in a healthy one. In order to improve this drawback, the delivery of drugs through nanocarriers can actively-target to tumor cells by grafting targeting ligands to the nanosystem that can recognize and bind to surface receptors overexpressed by these cells. In this thesis, two active-targeting ligands have been explored: the c(RGDfK) peptide and the Cetuximab antibody. First, PLGA nanoparticles with the photosensitizer ZnTriMPyP covalently attached and grafted with the c(RGDfK) peptide have been developed. Their physicochemical and photophysical properties have been studied, as also assessing their phototoxic activity. Covalent binding of the hydrophilic ZnTriMPyP to the surface of PEG-coated PLGA nanoparticles improves the phototoxicity and dark toxicity of the nanosystem compared to related nanocarriers with the photosensitizer occluded. The conjugation of c(RGDfK) peptide provides an enhancement in photodynamic action against tumor cells expressing the v3 integrin receptor but does not prevent damage to cells lacking this integrin. Secondly, immuno-photo-nanocarriers have been explored. For this, PEG-coated MSNPs decorated with phthalocyanine and Cetuximab have been synthesized. The physicochemical, photophysical and photobiological properties have been studied. Initially, this nanosystem has been prepared with the novel phthalocyanine ZnPcSMP, however, it is strongly aggregated and its photosensitizing ability is quenched when it is covalently attached to MSNPs. In contrast, the phthalocyanine IRDye700DX maintains its ability to generate singlet oxygen and thus the nanosystem achieves photodynamic action in cells. Furthermore, the conjugation of Cetuximab improves the aqueous dispersibility of these nanoparticles and enables their internalization in cells according to the EGFR expression level. Lastly, chemo-immuno-photo-nanocarriers have been developed. PEG-coated MSNPs grafted with phthalocyanine, Cetuximab and Doxorubicin have been designed to allow the release on-demand of the antineoplastic agent triggered by light. They have been characterized in terms of their physicochemical and photophysical properties, as also evaluating their phototoxicity in vitro. The attachment of small amounts of Doxorubicin onto nanoparticle surface induces a reduction in their singlet oxygen production ability and photodynamic activity. In contrast, with higher concentrations of Doxorubicin, the nanocarrier shows efficient and selective photokilling of EGFR-expressing cells mainly through singlet oxygen-induced cleavage of the Doxorubicin. Therefore, this novel triply functionalized nanosystem is an effective and safe nanodevice for light-triggered on-demand Doxorubicin delivery.