Insights into the myristoylated c-Src N-terminal Regulatory Element

Abstract

c-Src is a non-receptor tyrosine kinase that controls numerous cellular signaling pathways. c-Src implication in human cancers was brought into the attention in the 1980s. Since its discovery, unveiling of c-Src structural architecture and subsequent regulatory function focused on the folded domains cassette SH3-SH2-SH1(kinase), while the remaining N-terminal intrinsically disordered myristoylated SH4 and Unique domains were assumed to have a membrane-connecting function. c-Src membrane binding has been well-characterized as a two-prong association requiring the burial of its myristoyl moiety and the electrostatic interaction of the cluster of basic residues in the SH4 domain to the anionic lipids. Membrane binding of c-Src is mostly reversible, however accumulated evidence shows clustering and irreversible binding of a small fraction of c-Src molecules upon membrane anchoring. All the elements required for c-Src self-association are found in the N-terminal myristoylated SH4 domain. However, self-association through the strongly positively charged SH4 domain (+5 net charge) is counterintuitive. The structural basis of this self- association has been investigated in this thesis using Surface Plasmon Resonance. Performing individual mutations, we have determined that the alternate lysine residues at positions 5, 7 and 9 in the myristoylated SH4 domain enables c-Src self-association upon membrane binding. Further analysis reveals that the positive charge of the lysine residues is essential for clustering and thus a role of the lipids in the membrane as mediators of the c-Src self-association is proposed. Recently, it was shown that the (non-myristoylated) N-terminal region comprising the intrinsically disordered SH4-Unique domains and the adjacent globular SH3 domain formed a novel regulatory unit designated as the c-Src N-terminal Regulatory Element (SNRE). The (non- myristoylated) SNRE features an interdomain fuzzy complex, where the Intrinsically Disordered Regions: SH4 and Unique domains (IDR) maintain multiple weak contacts with the SH3 domain. The unavoidable question is whether the nature of this fuzzy complex is altered when the SH4 domain is in its native myristoylated form. In this thesis, characterization of the myristoylated SNRE has been performed using Nuclear Magnetic Resonance and various constructs of the SNRE in the myristoylated and non-myristoylated forms. We show that the myristoyl moiety increases the local concentration of the intrinsically disordered SH4 and Unique domains in the proximity of the SH3 domain by cooperatively favoring the intramolecular interactions that define the fuzzy complex. When c-Src is not bound to the membrane, the myristoyl moiety is harbored in the fuzzy interdomain complex through multiple binding sites in the SH3 domain. Finally, a preliminary characterization of the SNRE with the adjacent SH2 domain has revealed that the interface region connecting the SH3-SH2 could also be a key component of the SNRE.

c-Src es una tirosina quinasa no receptora que regula múltiples vías de señalización celular. Destaca su implicación en diversos tipos de cáncer en humanos. Desde su descubrimiento, el análisis de la arquitectura estructural de c-Src y posteriormente la función reguladora se centró en el casete de dominios plegados SH3-SH2-SH1 (quinasa), mientras que se asumió que la función de los dominios N-terminales intrínsecamente desordenados SH4 miristoilado y Unique era la unión a membrana. La asociación de c-Src a la membrana citoplasmática se caracteriza por la inserción del grupo miristoilo y la interacción electrostática del clúster de residuos básicos del dominio SH4 con los lípidos cargados negativamente. La interacción de c-Src con la membrana es en general reversible, aunque, se ha observado que una fracción minoritaria se une de manera permanente formando en su mayoría especies diméricas en la membrana. Esta dimerización de c-Src se produce mediante el dominio N-terminal SH4 miristoilado. Sin embargo, la autoasociación a través del dominio SH4 con una alta carga positiva (carga neta +5) es algo contradictoria. En la presente tesis se ha investigado la base estructural de esta autoasociación mediante Resonancia de Plasmones Superficiales. Mediante la realización mutaciones individuales en el dominio SH4 se determina que los residuos de lisina en las posiciones alternativas 5, 7 y 9 en el dominio SH4 miristoilado permiten la autoasociación de c- Src tras la unión a la membrana. Un análisis más detallado revela que la carga positiva de los residuos de lisina es esencial para la dimerización y, por lo tanto, se propone que los lípidos de la membrana son mediadores de la autoasociación de c-Src. Recientemente, se demostró que la región N-terminal (no miristoilada) que comprende los dominios intrínsecamente desordenados (SH4-Unique) y el dominio globular adyacente SH3 forman una unidad funcional conocida como Elemento Regulador N-terminal de c-Src (ERNS). El ERNS (no miristoilado) se caracteriza por la formación de un complejo difuso, donde las regiones intrínsecamente desordenadas: dominios SH4 y Unique mantienen múltiples interacciones débiles con el dominio SH3. La pregunta inevitable es si la naturaleza de este complejo difuso se altera cuando el dominio SH4 está en su forma nativa miristoilada. En esta tesis, se ha realizado la caracterización de la ERNS miristoilada mediante Resonancia Magnética Nuclear y utilizando varias construcciones del ERNS en las formas miristoilada y no miristoilada. Se demuestra que el grupo miristoílo aumenta la concentración local de los dominios SH4 y Unique intrínsecamente desordenados en la proximidad del dominio SH3 favoreciendo cooperativamente las interacciones intramoleculares que definen el complejo difuso. Cuando c- Src no está unido a la membrana, el grupo miristoílo se aloja de manera dinámica en el complejo difuso a través de múltiples sitios de unión en el dominio SH3. Por último, se ha realizado una caracterización preliminar del ERNS en presencia del dominio SH2 adyacente y ésta ha revelado que la región interfaz que conecta los dominios SH3-SH2 también podría ser un componente clave del ERNS.