Determinación por cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas de polifenoles y triterpenos pentacíclicos en aceituna de mesa y aceite de oliva. Estudio de su ingesta en ratas: concentración de dichos compuestos en plasma y contenido intestinal y efecto de la aceituna de mesa sobre lesiones preneoplásicas en el colon

Abstract

Los triterpenos pentacíclicos y polifenoles son compuestos bioactivos con propiedades saludables que se encuentran en plantas medicinales y comestibles, incluyendo Olea europaea L. En la tesis presentada se ha llevado a cabo un desarrollo de nuevos métodos para el análisis de estos compuestos en aceitunas de mesa, aceite de oliva virgen extra (AOVE), así como en el plasma y el contenido de colon después de la ingesta de estos alimentos. Además, también se ha investigado los efectos antitumorales in vivo del consumo de aceitunas de mesa sobre las lesiones preneoplásicas de colon. En primer lugar, se estableció un método para determinar los polifenoles en las aceitunas de mesa mediante extracción líquida y posterior análisis por LC-ESI-MS/MS. La validación mostró unos resultados satisfactorios de linealidad, sensibilidad, exactitud, precisión y recuperación. En segundo lugar, la extracción se validó para la determinación simultánea de triterpenos pentacíclicos y polifenoles a partir de la misma muestra de aceitunas previamente al análisis por LC-APCI-MS para triterpenos pentacíclicos y LC-ESI-MS/MS para polifenoles. El procedimiento sirvió para analizar tres variedades, encontrándose valores de triterpenos pentacíclicos más elevados en las aceitunas de mesa Marfil (3,62 ± 0,29 g/kg), seguido de las Arbequina (3,28 ± 0,07 g/kg) y Empeltre (2,77 ± 0,20 g/kg). El triterpeno pentacíclico más abundante fue el ácido maslínico (62-77%) y posteriormente el ácido oleanólico (23-38%) y eritrodiol (< 0,3%). En cuanto a los polifenoles, se detectaron dieciséis con concentraciones ligeramente más altas en Arbequina (1,04 ± 0,03 g/kg) con respecto a Marfil (0,87 ± 0,08 g/kg) y Empeltre (0,83 ± 0,05g/kg). El hidroxitirosol fue el mayoritario (~45%), seguido por verbascósido (28%) y luteolina (9%) tanto en Arbequina como en Empeltre. Aunque Marfil tiene porcentajes similares de hidroxitirosol y luteolina, se encontró un perfil diferente para otros polifenoles como verbascósido, que presentó un 0,10% y, tirosol un 23%. En tercer lugar, se investigaron las concentraciones plasmáticas de compuestos bioactivos después de la administración de AOVE de Arbequina a ratas Sprague-Dawley. El AOVE contiene 4 triterpenos pentacíclicos (149 ± 30 mg/kg) y 13 polifenoles (16,8 ± 0,3 mg/kg). Las concentraciones plasmáticas obtenidas después de la extracción líquida y el análisis LC-QTRAP-MS, revelaron la presencia de 1 triterpeno pentacíclico y 7 polifenoles. Todos los analitos alcanzaron su máxima concentración (Cmax) a los 15 minutos (tmax), disminuyeron de forma constante a lo largo del tiempo y aún se detectaron a los 120 min. Finalmente, se investigó el efecto de las aceitunas de mesa (3,85 g/kg) en las primeras etapas de la carcinogénesis de colon inducido por 1,2- dimetilhidrazina en ratas Sprague-Dawley. La administración de aceitunas Arbequina durante 49- días redujo los focos de criptas aberrantes y los focos con depleción de mucina en el colon total por un 54,1% y 35,7%, respectivamente. Concluyendo, las aceitunas de mesa contienen compuestos bioactivos en cantidades altas que, junto con las bajas concentraciones medidas en el plasma y la disminución de las lesiones preneoplásicas en el colon, sugeriría que su consumo regular, en el contexto de un estilo de vida saludable, podría contribuir a la prevención de enfermedades crónicas.

Pentacyclic triterpenes and polyphenols are bioactive compounds with health-protecting activities found in different medicinal and edible plants, among which stands out Olea europaea L. This thesis develops new methods for their analysis in table olives, extra virgin olive oil (EVOO) as well as in plasma and colon content after the intake of these foods. Moreover, the in vivo antitumoral effects of table olives was investigated on colonic pre-neoplastic lesions. Firstly, a new method to determine polyphenols in table olives by liquid extraction and LC-ESI-MS/MS was established. Validation showed satisfactory linearity, sensibility, accuracy, precision and recoveries. Secondly, the extraction was also validated for the determination of pentacyclic triterpenes concurrently with polyphenols from the same olives prior to LC-APCI-MS for pentacyclic triterpenes and LC-ESI- MS/MS for polyphenols. The analysis of three varieties yielded the greatest values of pentacyclic triterpenes in Marfil (3.62 ± 0.29 g/kg), followed by Arbequina (3.28 ± 0.07 g/kg) and Empeltre (2.77 ± 0.20 g/kg) table olives. The most abundant pentacyclic triterpene was maslinic acid (62- 77%), ensued by oleanolic acid (23-38%) and erythrodiol (< 0.3%). Sixteen polyphenols were detected with concentrations slightly higher in Arbequina (1.04 ± 0.03 g/kg) with respect to Marfil (0.87 ± 0.08 g/kg) and Empeltre (0.83 ± 0.05 g/kg). Hydroxytyrosol was the predominant (~45%), succeeded by verbascoside (28%) and luteolin (9%) in Arbequina and Empeltre. Although Marfil hold similar percentages of hydroxytyrosol and luteolin, a different profile was found for other polyphenols with verbascoside showing a 0.10% and tyrosol reaching a 23%. Thirdly, the plasmatic concentrations of bioactive compounds after the administration of Arbequina EVOO to Sprague- Dawley rats was investigated. EVOO contained 4 pentacyclic triterpenes (149 ± 30 mg/kg) and 13 polyphenols (16.8 ± 0.3 mg/kg). Plasmatic concentrations obtained after liquid extraction and LC- QTRAP-MS analysis revealed the presence of 1 pentacyclic triterpene and 7 polyphenols. All analytes showed maximum concentration (Cmax) at 15 minutes (tmax) followed by a steady decrease and still were detected at 120 min. Finally, the effect of table olives (3.85 g/kg) in early stages of colon carcinogenesis induced by 1,2-dimethylhydrazine in Sprague-Dawley rats was investigated. The administration of Arbequina olives for 49-days reduced aberrant crypt foci and mucin depleted foci in total colon in a 54.1% and 35.7%, respectively. In conclusion, table olives contain bioactive compounds in high amounts that together with their low plasmatic concentrations and the decrease of preneoplastic lesions suggests that a regular consumption of this food in the context of a healthy lifestyle, could contribute to the prevention of chronic diseases.