Proteòmica del plasma seminal i de les seves vesícules extracel·lulars: nova font de biomarcadors útils en l’estudi de la funció espermàtica i la infertilitat masculina

Abstract

La infertilitat és un problema freqüent a escala mundial cada cop més comú. No obstant això, la manca de comprensió de la biologia reproductiva masculina i dels mecanismes moleculars alterats en pacients infèrtils resulta en una disponibilitat limitada i insuficient d’eines diagnòstiques i pronòstiques per a l’avaluació de la fertilitat masculina, així com de tractaments per a la infertilitat. Tot i que l’espermatozoide és la peça clau en la transmissió de la informació paterna a l’embrió, hi ha evidències que els fluids secretats per l’epidídim i les glàndules sexuals accessòries, incloent-hi les vesícules extracel·lulars, juguen un paper molt més important en la reproducció masculina que el de simplement ser el mitjà de transport dels espermatozoides. La hipòtesi d’aquesta tesi és que l’aplicació de tècniques proteòmiques d’alt rendiment en l’estudi del plasma seminal de pacients infèrtils podria permetre la identificació de nous potencials biomarcadors clínics no invasius que permetin una millora en la classificació actual de la infertilitat i en l’optimització del seu diagnòstic i tractament, i que ens apropin al diagnòstic personalitzat de la infertilitat masculina. A més, l’estudi de la comunicació intercel·lular entre vesícules extracel·lulars i espermatozoides, i l’aplicació de noves metodologies per a l’obtenció de poblacions específiques de diferents tipus de vesícules extracel·lulars, podrien revelar la veritable importància de les vesícules extracel·lulars de l’epidídim i de les glàndules sexuals accessòries en la funció espermàtica, el que proporcionaria les bases per a futurs estudis orientats a identificar nous biomarcadors diagnòstics i pronòstics, així com desenvolupar noves teràpies per a millorar la fertilitat masculina. Per tant, els objectius d’aquesta tesi doctoral són els següents: 1. Analitzar els perfils proteòmics del plasma seminal de pacients amb diferents tipus d’infertilitat amb la finalitat d’identificar nous potencials biomarcadors de fertilitat/infertilitat útils per a l’assistència clínica. 1.1. Caracteritzar el proteoma del plasma seminal de pacients infèrtils categoritzats segons els paràmetres seminals (normozoospèrmics, astenozoospèrmics, oligozoospèrmics i azoospèrmics). 1.2. Caracteritzar el proteoma del plasma seminal de pacients infèrtils afectes d’hipogonadisme hipogonadòtropic, abans i després de la teràpia de reemplaçament de testosterona. 2. Explorar la possible comunicació intercel·lular entre les vesícules extracel·lulars seminals i l’espermatozoide, i determinar el seu impacte en la funció espermàtica. 2.1. Demostrar la participació dels epididimosomes (vesícules extracel·lulars secretades per l’epidídim) en la transferència de proteïnes entre l’epidídim i els espermatozoides. 2.2. Determinar l’impacte de les vesícules extracel·lulars seminals CD63+ en la funció espermàtica mitjançant el seu aïllament amb tècniques d’immunoafinitat, i caracteritzar el seu contingut mitjançant proteòmica d’alt rendiment.

Infertility is a common and rising problem worldwide. However, the lack of understanding of male reproductive biology and the molecular mechanisms altered in infertile patients results in a limited and insufficient availability of male infertility diagnostic and prognostic tools, as well as fertility treatments. Although the sperm is the key piece in the transmission of paternal information to the embryo, there is evidence that the fluids secreted by the epididymis and male accessory sex glands, including the seminal EVs, play a pivotal role in male reproduction more than simply being a medium to carry the spermatozoa. The hypothesis of this thesis is that the use of high-throughput proteomic techniques for the study of the seminal plasma of infertile patients could allow the identification of novel and non-invasive clinical biomarkers, which could result in an improvement of the current male infertility stratification and an optimization of their diagnostic and treatment, moving towards a personalized evaluation of male infertility. Also, the study of the intercellular communication between seminal EVs and sperm, and the application of new methodologies to obtain specific populations of the different types of EVs, could contribute to revealing the real biological roles of seminal EVs from the epididymis and the male accessory sex glands in sperm function. These findings could provide the basis for future studies aimed at identifying new diagnostic and prognostic biomarkers, as well as developing new therapies to improve male fertility. Therefore, the objectives of this doctoral thesis are: 1. To analyze the seminal plasma proteomic profile of patients with different types of infertility in order to identify new potential biomarkers of fertility/infertility useful for clinical care. 1.1. To define the seminal plasma proteome signatures of infertile patients categorized according to their seminal parameters (normozoospermia, asthenozoospermia, oligozoospermia, and azoospermia). 1.2. To characterize the seminal plasma proteome of infertile patients with hypogonadotropic hypogonadism, before and after testosterone replacement therapy. 2. To explore the potential intercellular communication between seminal EVs and sperm, and to determine the impact of this on sperm function. 2.1. To demonstrate the participation of epididymosomes (EVs secreted by the epididymis) in protein transfer between epididymis and sperm. 2.2. To determine the impact of CD63+ seminal EVs on sperm function by isolating the EVs with immunoaffinity techniques, and to characterize their protein content by high-throughput proteomics.