Biological control approaches of Meloidogyne spp. in vegetable crops : from application of selected antagonists to suppressive soils

Abstract

Root-knot nematodes (RKN), Meloidogyne spp., are the most economically important genus of plant parasitic nematodes that cause considerable damage and yield losses of horticultural crops worldwide. RKN management strategies tend to reduce chemical nematicides by encouraging alternative control methods like the use of plants bearing resistance genes (R-genes) and/or by microbe-inducing plant resistance, and the antagonistic potential of soils. In the thesis, two biological control approaches of Meloidogyne spp. were evaluated: 1) the application of selected nematode antagonists, the fungus Pochonia chlamydosporia and the bacteria Bacillus firmus I-1582 (Bf I-1582), to know its ability to induce plant resistance, and 2) the level of soil suppressiveness of vegetable production sites conducted under organic or integrated standards. Regarding the ability of P. chlamydosporia and Bf I-1582 to induce plant resistance, the results of this thesis provide evidence that two out of five P. chlamydosporia isolates (M10.43.21 and M10.55.6) and Bf I-1582 are able to induce systemic resistance against M. incognita in the susceptible tomato (Solanum lycopersicum) cv. Durinta but not in the cucumber (Cucumis sativus) cv. Dasher II in split-root experiments. In addition, the cardinal temperatures for the Bf I-1582 growth and biofilm formation were determined in order to improve its use in field conditions. Moreover, Bf I-1582 was transformed with GFP to study its effect on nematode eggs and on tomato and cucumber root colonization. In tomato, the number of egg masses and the number of eggs per plant were reduced by M10.43.21 and M10.55.6 P. chlamydosporia isolates and by Bf I-1582. P. chlamydosporia isolates colonized both tomato and cucumber roots, being the M10.43.21 and the M10.55.6 isolates the best root colonizers in tomato and cucumber, respectively. In the case of Bf I-1582, the bacteria colonized endophytically roots of both plants, but highest values were recorded in tomato. The dynamic regulation of genes related to jasmonic acid (JA) and salicylic acid (SA) was determined by RT-qPCR at three different times after nematode inoculation (dani). Bf I-1582 primed tomato plants by both SA and JA at all the times in tomato, but only SA at 7 dani in cucumber. Regarding P. chlamydosporia, isolate M10.43.21, induced the expression of the SA pathway in tomato at 0, 7 and 42 dani. The JA pathway was also up regulated at 7 dani. These results show the similar model of dynamic regulation of these plant hormone pathways related to plant defense mechanisms against the nematode. Also, Bf I-1582 grew and formed biofilm between 15 and 45 ºC, being 35 ºC the optimal temperature. Bf I-1582GFP was adhered to the egg shell and inside the eggs. Also, Bf I-1582GFP colonized root hairs and epidermal cells and some bacteria were found inside the tomato root. In cucumber, few bacteria were observed on epidermal cells and the bacteria were no found inside the root. In relation to the level of soil suppressiveness of vegetable production it was carried out a study in four organic and two integrated vegetables production standards sites located in north-eastern Spain. The fluctuation both of Meloidogyne population density and fungal egg parasitism were determined during the rotation sequences in two years (2015-2016). Five out of six of these sites were suppressive soils to Meloidogyne spp. The percentage of fungal egg parasitism ranged from 11.2 to 55 % and P. chlamydosporia was the only fungal species isolated from the eggs. In parallel, two tomato pots experiments were carried out using sterilized and non-sterilized soils from each site and inoculated with second-stage juveniles (J2) to achieve a rate of 1 J2 cm-3 of soil. In both, in five of them the number of nematode eggs per plant was reduced in all nonsterilized soils compared to the sterilizes ones. Also, P. chlamydosporia was the only fungal species isolated from parasitized nematode eggs.

Meloidogyne spp. (RKN) es el género de nematodos fitopatógenos que causan las mayores pérdidas económicas y que más afectan al rendimiento de cultivos hortícolas a nivel mundial. Las estrategias de manejo de RKN tienden a sustituir la utilización de nematicidas químicos por medidas de control alternativas como son el uso de plantas con genes de resistencia (genes R) y/o mediante la utilización de microorganismos inductores de resistencia, y el potencial antagónico del suelo. En esta tesis, se han evaluado dos enfoques de control biológico: 1) la aplicación de microorganismos antagónicos, el hongo Pochonia chlamydosporia (Pc) y la bacteria Bacillus firmus I-1582 (Bf I-1582) para evaluar su capacidad de inducir mecanismos de resistencia, y 2) el nivel de supresividad del suelo de diferentes lugares bajo estándares de producción orgánica e integrada. Con respecto a la capacidad de Pc y Bf I-1582 para inducir resistencia, los resultados de esta tesis muestran que dos (M10.43.21 y M10.55.6) de los cinco aislados de Pc utilizados y la bacteria Bf I-1582 inducen resistencia sistémica frente a M. incognita en el tomate susceptible (Solanum lycopersicum) cv. Durinta pero no en el pepino (Cucumis sativus) cv. Dasher II usando el modelo split-root. En el caso de Bf I-1582, se determinaron las temperaturas cardinales para el crecimiento y la formación de biofilms de Bf I-1582 con el fin de mejorar su utilización en condiciones de campo y se transformó con la GFP para estudiar su efecto sobre los huevos de RKN y sobre la colonización radicular. Los aislados M10.43.21 y M10.55.6 de Pc y Bf I-1582 redujeron el número de masas de huevos y el número de huevos por planta en tomate. Todos los aislados de Pc colonizaron raíces de tomate y pepino, siendo los aislados M10.43.21 y M10.55.6 los mejores colonizadores en tomate y pepino, respectivamente. En el caso de Bf I-1582, la bacteria colonizó endofíticamente las raíces de ambas plantas, pero los valores más altos se registraron en tomate. La expresión de los genes relacionados con el ácido jasmónico (JA) y el ácido salicílico (SA) se determinó a tres tiempos tras la inoculación de nematodos (dani). En plantas de tomate inoculadas con Bf I-1582 la expresión de los genes relacionados con SA y JA aumentaron en los tres puntos, pero en pepino solo se observó un incremento de expresión en el gen relacionado con la ruta de SA a los 7 dani. Con respecto a Pc, el aislado M10.43.21, indujo la expresión de la vía SA en tomate a los 0, 7 y 42 dani. La vía JA también aumentó su expresión a los 7 dani. Además, Bf I-1582 creció y formó biofilms entre 15 y 45 ºC, siendo 35 ºC la temperatura óptima. Bf I-1582GFP se adhirió a la cubierta y al interior de los huevo de M. incognita. Además, Bf I-1582GFP en tomate colonizó los pelos radiculares, así como las células epidérmicas y se encontraron algunas bacterias en el interior radicular. En el pepino, se observó un menor número de bacterias en las células epidérmicas y no se encontraron bacterias en el interior radicular. En relación con el nivel de supresión del suelo, se realizó un estudio en cuatro lugares de producción hortícola orgánica y dos de producción integrada en el noreste de España. Durante la secuencias de rotación en 2015-2016 se determinó la fluctuación tanto de la densidad de población de Meloidogyne en suelo como del parasitismo de huevos de nematodos. Cinco de estos sitios resultaron ser supresivos a Meloidogyne spp. Paralelamente, se llevaron a cabo dos experimentos en macetas con suelo esterilizado y no esterilizado de cada sitio donde las plantas de tomate se inocularon con juveniles (J2) para lograr una tasa de 1 J2 cm-3 de suelo. En cinco de ellos, el número de huevos de nematodos por planta se redujo en todos los suelos no esterilizados en comparación con los esterilizados. Respecto al parasitismo, Pc fue la única especie aislada de los huevos de Meloidogyne spp. p

Els nematodes formadors de gal·les, Meloidogyne spp., és el gènere més important nematodes fitoparàsits que causen danys considerables i generen pèrdues econòmiques en cultius hortícoles arreu del món. Les estratègies actuals de gestió de Meloidogyne solen reduir l’ús dels nematicides químics fomentant mètodes de control alternatius com l’ús de plantes amb gens de resistència (gens R) i/o l’ús de la resistència vegetal induïda per microorganismes, i el potencial antagonista dels sòls. En la present tesis, dos aproximacions al control biològic de Meloidogyne spp. van ser estudiades: 1) l’aplicació d’antagonistes dels nematodes: el fong Pochonia chlamydosporia i el bacteri Bacillus firmus aïllat I-1582 i es a avaluar la seva capacitat per induir resistència vegetal, i 2) el nivell de supressivitat de sòls de producció vegetal orgànica o integrada. Respecte a la capacitat de P. chlamydosporia i B. firmus I-1582 (Bf I-1582) a induir resistència vegetal, els resultats d’aquesta tesis van donar evidències que dos de cinc aïllats de P. chlamydosporia (M10.43.21 i M10.55.6) i Bf I-1582 induien resistència sistèmica enfront M. incognita en tomàquet susceptible (Solanum lycopersicum) cv. Durinta però no en cogombre (Cucumis sativus) cv. Dasher II en experiments “split-root”. A més, les temperatures cardinals de creixement i de formació de biofilm de Bf I-1582 van ser determinades per tal de millorar el seu ús en condicions de camp. A més, el bacteri va ser transformat amb GFP per estudiar el seu efecte sobre els ous del nematode i la seva colonització sobre les arrels de tomàquet i cogombre per microscopia de rastreig làser confocal. En tomàquet, tant el nombre de masses d'ou com el nombre d'ous per planta es va veure reduït quan s’aplicaven tant els aïllats fúngics com el bacteri. Els aïllats de P. chlamydosporia colonitzaven les arrels de tomàquet i cogombre, però diferien en el nivell de colonització. L’aïllat M10.43.21 va ser el millor colonitzador de les arrels de tomàquet mentre que l’aïllat M10.55.6 ho va ser per cogombre. En el cas de Bf I-1582, el bacteri va ser capaç de colonitzar endofíticament les arrels de les dues plantes, però es va trobar un 61% més de densitat d’ADN de bacteri en arrels de tomàquet. La regulació dinàmica dels gens relacionats amb l’àcid jasmònic (JA) i l’àcid salicílic (SA) a tres temps diferents van ser avaluats: 7 dies després de la inoculació de l’antagonista i just després de la inoculació del nematode (0 dani), 7 dies desprès de la inoculació del nematode (7 dani) i 40 dies desprès de la inoculació del nematode (40 dani). Les dues vies SA (gen PR-1) i JA (gen Lox D) van ser sobre-expressades plantes de tomàquet a 0 dani, reduint el nombre de masses d’ou al final de l’experiment “split-root” quan es va inocular amb Bf I-1582. No obstant, no hi va haver diferencies en l’expressió dels gens relacionats SA (PR 1) i JA (Lox D) en cogombre inoculat amb el bacteri com tampoc en el nombre de masses d’ou produïdes en les arrels de cogombre. A 7 dani, el gen relacionat amb el JA (Lox D) estava sobre-expressat en tomàquet i podria afectar el desenvolupament del nematode i la seva reproducció. En cogombre, la via del SA (Pal I) estava sobre-expressada tant en les plantes inoculades amb M. incognita com en les co-inoculades amb el bacteri i el nematode. A 40 dani, quan va començar l’eclosió dels ous i es van produir noves infeccions a l’arrel, les plantes de tomàquet co-inoculades amb els nematode 2 i Bf I-1582 tenia reprimit el gen relacionat amb el JA (Lox D), mentre que el gen relacionat amb la via del SA (PR 1) estava sobre-expressat en plantes co-inoculades i també amb només Bf I-1582, però va ser reprimit en plantes inoculades només amb el nematode. En cogombre, les dues vies, JA i SA, van ser reprimides en plantes inoculades amb M. incognita però només la JA en plantes co-inoculades. Respecte l’aïllat de P. chlamydosporia M10.43.21, va induir l’expressió de la via del SA en arrels de tomàquet a 0, 7 i 42 dani. La via del JA va ser també sobre-expressada a 7 dani. Per tant, alguns aïllats de P. chlamydosporia i l’aïllat Bf I-1582 poden induir resistència sistèmica envers al nematode, encara que depèn de l’espècie vegetal. Aquests resultats han demostrat el model similar de regulació dinàmica d’aquestes vies d’hormones vegetals relacionades amb mecanismes de defensa de les plantes contra el nematode. El bacteri Bf I-1582 va créixer en el rang de temperatures des de 15 ºC a 45 ºC, sent 35 ºC la temperatura òptima de creixement tant en medi sòlid com en líquid, però no a 10 ºC i 50 ºC. Igualment, es va observar la formació de biofilm entre 15 ºC i 45 ºC però tampoc a 10 ºC ni a 50 ºC, sent més gruixut i uniforme a 35 ºC. La degradació de la closca del nematode i la colonització dels ous per Bf I-1582 GFP va mostrar que a 3 dies desprès de la seva inoculació (dai) el bacteri estava envoltant i degradant l'ou del nematode; a 5 dai, colònies de bacteri es van adherir a la closca de l’ou i es van trobar alguns bacteris dins de l’ou; a 10 dai, el bacteri era completament adherit a la closca de l’ou i dins de l’ou. A més, Bf I-1582GFP va colonitzar les pèls radiculars i cèl·lules epidèrmiques a 5 dai; es van observar colònies de bacteris en pèls radiculars de tomàquet i alguns bacteris dins de l’arrel a 10 dai. En cogombre, es van observar pocs bacteris a les cèl·lules epidèrmiques a 5 dai i no es va trobar el bacteri dins de l’arrel a 10 dai. En relació al nivell de supressivitat del sòl, es va realitzar un estudi a sis parcel·les de producció d’hortalisses localitzades al nord-est d’Espanya. Quatre realitzaven producció orgànica (M10. 16, M10.41, M10.55, i M10.56) i dues (M10.43 i M10.45) producció integrada. La fluctuació de la densitat de població de Meloidogyne i el parasitisme d’ous per part de fongs van ser determinats durant la seqüència de rotació de cultius durant dos anys (2015-2016). Cinc dels sols estudiats eren sòls supressius a Meloidogyne spp. El percentatge de parasitisme d’ous va variar de 11.2 a 55 % i P. chlamydosporia va ser l'única espècie fúngica aïllada dels ous. En paral·lel, dos experiments es van dur a terme utilitzant sòl de cada parcel·la. Una part de cada sòl es va esterilitzar i es va barrejar amb sorra estèril, i una altre part no es va esterilitzar i es va barrejar també amb sorra estèril amb una relació 1:1 i es va col·locar en testos de 3-l. El cultivar susceptible de tomàquet Durinta es va trasplantar en cada test i es va inocular amb juvenils de segon estadi (J2) amb un nivell de 1 J2 cm-3 de sòl. En els dos experiments en testos, els nombre d’ous per planta es va reduir (P<0.05) en tots els sòls no esterilitzats comparats amb els estèrils, excepte en el M10.45. També, P. chlamydosporia va la única espècie fúngica aïllada d’ous parasitats de nematodes. P. chlamydosporia és el fong més freqüent i més prevalent amb una alta plasticitat capaç d’adaptar-se a les pràctiques agronòmiques en un sistema de producció vegetal molt pertorbat.