Oligosacáridos de la leche materna, un reto para las leches de fórmula: Ingeniería de proteínas de la enzima lacto-N-biosidasa de Bifidobacterium bifidum para la síntesis de lacto-N-tetraosa

Abstract

Actualment es tenen clares evidències dels nombrosos beneficis que els oligosacàrids de la llet materna (human milk oligosaccharides, HMOs) proporcionen als nounats, ja sigui a nivell local o sistèmic. La llet humana es considera única degut a la concentració, qualitat i complexitat dels seus HMOs. Es coneix que aquestes molècules exerceixen diverses funcions biològiques actuant com a prebiòtics, inmuno- moduladors, inhibidors de patògens, entre altres. A dia d’avui s’han identificat més de 200 estructures d’HMOs diferents, essent impossible la seva obtenció a partir de fonts naturals. Degut a la seva elevada complexitat estructural, la síntesi química a gran escala d’aquests carbohidrats segueix sent un repte, requerint de nombroses etapes sintètiques. Per aquet motiu, les llets de fórmula sol contenen principalment HMOs d’estructures simples com 2’FL, DFL y 3’/6’-SL. La síntesi enzimàtica es una interessant alternativa sintètica per la producció d’aquests compostos, ja que, gràcies als enzims, permet controlar la estereo- y regioselectivitat de l’oligosacàrid format. La llet humana presenta com a HMO majoritari el tetrasacàrid lacto-N-tetraosa (LNT) i els seus derivats fucosilats i/o sialilats. L’enzim lacto-N-biosidasa de B.bifidum es el responsable d’hidrolitzat el tetrasacárido LNT en el metabolisme dels infants alimentats amb llet materna.

Amb l’objectiu de produir el compost LNT, en aquesta tesi s’ha realitzat el redisseny de l’enzim lacto-N- biosidasa de B.bifidum (LnbB) amb la finalitat d’obtenir un biocatalitzador eficient per a la producció d’aquest compost. Per aquest fita, s’han aplicat diferents estratègies: i) redisseny racional basat en l’estudi estructural dels subsetis negatius de l’enzim LnbB, ii) redisseny dels subsetis positius de LnbB emprant eines computacionals i iii) síntesis seqüencial de la molècula LNT.

L’enzim LnbB pertany a la família GH20 i catalitza la hidròlisis de LNT generant els disacàrids lactosa i lacto- N-biosa. En aquesta tesi s’han redissenyat els subsetis de LnbB emprant mètodes d’enginyeria de proteïnes, per avaluar la síntesi del tetrasacàrid mitjançant la estratègia de transglicosidació per control cinètic utilitzant donadors glicosídics activats. Concretament pel redisseny racional dels subsetis negatius de la proteïna, s’han realitzat estudis de conservació i estructurals, seleccionant i modificant aquells aminoàcids involucrats en la unió i estabilització de la molècula donadora. D’altra banda, degut a què l’enzim no presenta subsetis definits d’unió per la molècula aceptora, s’ha utilitzat el software BINDSCAN desenvolupat en el Laboratori de Bioquímica d’IQS per al redisseny dels subsetis positius.

En aquesta tesi també s’ha explorat la síntesi seqüencial del compost LNT basada en la estratègia glicosintasa, combinant els enzims β-galactosidasa Bacillus circullas (Bgac) E233G i LnbB (D320E_W394F).

Actualmente se tienen evidencias de los numerosos beneficios que los oligosacáridos de la leche materna (human milk oligosaccarides, HMOs) confieren a los recién nacidos, ya sea a nivel local o sistémico. La leche humana se considera única debido a la concentración, calidad y complejidad de sus HMOs. Es conocido que estas moléculas ejercen diversas funciones biológicas actuando como prebióticos, inmuno- moduladores, inhibidores de patógenos, entre otras. Hasta la fecha se han identificado más de 200 estructuras de HMOs diferentes, siendo imposible su obtención a partir de fuentes naturales. Debido a su elevada complejidad estructural la síntesis química a gran escala de estos carbohidratos sigue siendo un reto, requiriendo de numerosas etapas sintéticas. Por esto motivo, las leches de formula contienen principalmente HMOs de estructuras simples como 2’FL, DFL y 3’/6’-SL. La síntesis enzimática es una interesante alternativa sintética para la producción de estas moléculas, ya que, gracias a las enzimas, permite controlar la estero- y regioselectividad del oligosacárido formado. La leche humana presenta como HMO mayoritario el tetrasacárido lacto-N-tetraosa (LNT) y sus derivados fucosilados y/o sialilados. La enzima lacto-N-biosidasa de B.bifidum es la responsable de hidrolizar el tetrasacárido LNT en el metabolismo del recién nacido alimentado con leche materna.

Con el objetivo de producir el compuesto LNT, en esta tesis se ha llevado a cabo el rediseño de la enzima lacto-N-biosidasa de B.bifidum (LnbB) con el fin de obtener un biocatalizador eficiente para la producción de este tetrasacárido. Para ello, se han aplicado diferentes estrategias: i) rediseño racional basado en el estudio estructural de los subsitios negativos de la enzima LnbB, ii) rediseño de los subsitios positivos de LnbB a partir de herramientas computacionales y iii) síntesis secuencial del compuesto LNT.

La enzima LnbB pertenece a la familia GH20 y cataliza la hidrólisis de la molécula de LNT, dando lugar a los disacáridos lactosa y lacto-N-biosa. En esta tesis se han rediseñado los subsitios de la enzima LnbB empleando métodos de ingeniería de proteínas, para testar así su síntesis mediante la estrategia de transglicosidación por control cinético empleando dadores de glicosilo activados. Concretamente para el rediseño racional de los subsitios negativos de la enzima se han realizado estudios de conservación y estructurales, seleccionando y modificando aquellos aminoácidos involucrados en la unión y estabilización de la molécula dadora. Por otro lado, dado que la enzima no presenta subsitios definidos de unión al aceptor, para el rediseño de los subsitios positivos se ha empleado el software BINDSCAN desarrollado en el Laboratorio de Bioquímica de IQS.

En esta tesis también se ha explorado la síntesis secuencial del compuesto LNT empleando la estrategia glicosintasa, combinando las enzimas β-galactosidasa Bacillus circullas (Bgac) E233G y LnbB (D320E_W394F).

Nowadays there are evidences of the potentials health benefits that human milk oligosaccharides (HMOs) confer to the babies at local and systemic levels. Human milk is considered as a gold standard for the infant nutrition due to the concentration, quality, and complexity of their HMOs. Are known that these compounds play essential biological functions acting as a prebiotics, inmuno-modulators, pathogens inhibitors, such others. To date, more than 200 HMOs structures have been identified, being their obtention from natural resources impossible. Due to their structural complexity, the large-scale chemical synthesis of these carbohydrates remains a challenge. For this reason, formula milks only contain HMOs with simple structures such as 2’FL, DFL y 3’/6’-SL. Enzymatic synthesis is an alternative synthetic tool to synthetize HMOs, due to the stere- and regioselectivity action of enzymes. Lacto-N-tetraose (LNT) and their sialylated and fucosylated derivatives are the most abundant HMOs in human milk. Lacto-N-biosidase from B.bifidum is responsible for the hydrolysis of this compound in the metabolism of breast fed-babies.

With the aim to synthesize LNT, in this thesis the enzyme lacto-N-biosidase from B.bifidum (LnbB) has been redesigned in order to generate an efficient biocatalyst able to synthetize the desired tetrasaccharide. For this, different strategies have been applied: i) rational redesign based on structural studies of the negative subsites of LnbB, ii) redesign of the positive subsites of LnbB using computational tools and iii) sequential synthesis of LNT.

LnbB belongs to GH20 family and catalyses the hydrolysis of LNT compound giving the disaccharides lactose and lacto-N-biose. In this thesis the subsites of LnbB have been redesign using protein engineering methods, to test its synthesis by kinetically controlled transglycosylation using activated glycosyl donors. For the rational redesign of the negative subsites of LnbB, conservation and structural studies have been carried out, selecting and modifying the residues involved in the binding and stabilization of the donor molecule. By contrast, the redesign of the positive subsites of the enzyme has been done using the software BINDSCAND developed in the IQS Biochemistry Laboratory since LnbB doesn’t present defined acceptor binding subsites,

Also, in this thesis the sequential synthesis of LNT molecule has also been explored based on the glycosynthase strategy, combining the β-galactosidasa from Bacillus circullas (Bgac) E233G and LnbB (D320E_W394F) enzymes.