Biomedical applications of PolyPurine Reverse Hoogsteen hairpins: immunotherapy and gene repair

Abstract

This thesis is centered on the study of PolyPurine Reverse Hoogsteen (PPRH) hairpins technology as a tool for both gene silencing and gene editing. PolyPurine Reverse Hoogsteen (PPRH) hairpins are nonmodified single-stranded DNA molecules formed by two antiparallel polypurine mirror repeat domains linked by a five-thymidine loop that are bound through intramolecular reverse Hoogsteen bonds, thus allowing the formation of the hairpin structure. PPRHs can bind in a sequence specific manner to their polypyrimidine target sequence in the dsDNA by Watson-Crick bonds, thus producing a triplex structure and inhibiting the expression of the targeted gene. As a first part of this thesis we increased our knowledge about the usage of PPRHs as gene silencing tools. On the one hand, we explored the pharmacogenomic response in PC3 prostate cancer cells upon the treatment with a PPRH designed against the antiapoptotic survivin gene that we had previously validated in our laboratory. The analyses demonstrated that the PPRH was specific towards its intended target gene and the genomic response involved a deregulation of vital cell processes such as Apoptosis, Regulation of cell proliferation, Cellular response to stress and Prostate cancer, thus severely affecting cell viability. We also determined the lack of hepatotoxicity and nephrotoxicity in vitro of PPRH molecules in hepatic and renal human cell lines, respectively. On the other hand, we were able to apply the PPRHs technology for immunotherapy approaches. We centered our studies in the inhibition of the CD47/SIRPα and the PD-1/PD-L1 pathways that promote the escape of tumor cells from host’s immunosurveillance system. PPRHs were designed to silence those genes in macrophage/cancer cells co-culture experiments, showing an increase in the killing of cancer cells by macrophages. We also determined that apoptosis was the mechanism responsible for this cancer cell death. The second part of this thesis is focused on the usage of PPRHs as gene editing tools. Repair-PPRHs are hairpins that bear an extension sequence at one end of the molecule which is homologous to the DNA sequence to be repaired but containing the wild-type nucleotide instead of the mutated one. Previous works performed in our laboratory demonstrated that repair-PPRHs were able to correct a representative collection of point mutations (substitutions, double substitutions, deletions and insertions) in the endogenous locus of the dihydrofolate reductase (dhfr) gene in different Chinese Hamster Ovary (CHO) mutant cell lines. In this work, we have demonstrated the generality of action of the repair-PPRHs by correcting different single-point mutations in the adenine phosphoribosyltransferase (aprt) gene in CHO mutant cells. Moreover, we determined that the correction was specific since we did not detect any off-target effect in the repaired genome. We also gained insight into the mechanism responsible for the repair event, showing the formation of a D-loop structure upon the binding of the PPRH to its target sequence that stimulates homologous recombination. Finally, we used repair-PPRHs to try to correct a single point mutation in the FANCA gene responsible for Fanconi anemia in a patient-derived human cell line, to extend the potential of PPRHs to correct mutations responsible for human monogenic diseases.

Esta tesis se centra en el estudio de la tecnología de los PPRHs (PolyPurine Reverse Hoogsteen hairpins) como herramienta de silenciamiento y edición génica. Los PPRHs son moléculas no modificadas de ssDNA que están formadas por dos dominios antiparalelos de polipurinas unidas entre sí mediante un puente de 5 timinas. Ambos dominios de polipurinas establecen enlaces de tipo Hoogsteen reverso, permitiendo así la formación de una estructura tipo pinza. Los PPRHs pueden unirse de manera específica a su secuencia diana de polipirimidinas en el dsDNA mediante enlaces Watson-Crick, dando lugar a la formación de un triplex e inhibiendo la expresión del gen diana. En la primera parte de esta tesis hemos profundizado en el uso de los PPRHs como herramienta de silenciamiento génico. Por un lado, exploramos la respuesta farmacogenómica en células de cáncer de próstata PC3 tratadas con un PPRH dirigido contra el gen antiapoptótico survivina que previamente habíamos validado en el laboratorio. Los análisis demostraron que el PPRH era específico contra la survivina, lo que provocaba la desregulación de procesos celulares vitales tales como Apoptosis, Proliferación celular, Respuesta a estrés o Cáncer de próstata, afectando severamente a la viabilidad celular. Además, también comprobamos in vitro que los PPRHs no producen citotoxicidad hepática ni renal en células hepáticas y renales, respectivamente. Por otro lado, hemos sido capaces de utilizar la tecnología de los PPRHs en aplicaciones inmunoterapéuticas. Estos estudios se han centrado en la inhibición de las vías CD47/SIRPα y PD-1/PD-L1 que promueven la evasión de las células tumorales del sistema inmune del huésped. Se utilizaron PPRHs para silenciar estos genes en co-cultivos de macrófagos/células cancerosas y se observó un incremento en la muerte de células tumorales debida a la acción de los macrófagos. También determinamos que la apoptosis era el principal mecanismo por el cual las células tumorales morían. La segunda parte de esta tesis esta centrada en el uso de los PPRHs como herramienta de edición génica. Los PPRHs-reparadores son pinzas que contienen una secuencia adicional en un extremo del oligonucleótido que es homóloga a la secuencia de DNA que se quiere reparar pero conteniendo el nucleótido corregido en vez del mutado. Trabajo previo del laboratorio demostró que los PPRHs-reparadores eran capaces de corregir una colección representativa de mutaciones puntuales (substituciones, doble substitución, inserciones y deleciones) en el locus endógeno del gen dihidrofolato reductasa (dhfr) en diferentes líneas celulares mutantes de ovario de hámster chino (CHO). En esta tesis, hemos demostrado la generalidad de acción de los PPRHs-reparadores corrigiendo diferentes mutaciones puntuales en el gen adenina fosforibosiltransferasa (aprt) en células CHO mutantes. Adicionalmente, hemos demostrado que esta corrección mediada por los PPRHs-reparadores es específica y no ha generado ningún efecto off- target in ningún lugar del genoma reparado. Desde el punto de vista del mecanismo molecular por el cual se produce la reparación, hemos observado la formación de una estructura D-loop en el dsDNA debida a la unión del PPRH-reparador a su secuencia diana, estimulando de esta manera un proceso de recombinación homóloga. Por último, hemos intentado usar PPRH-reparadores para corregir una mutación puntual en el gen FANCA responsable de la anemia de Fanconi en una línea celular humana derivada de un paciente con el objetivo de extender el potencial de los PPRHs para la corrección de mutaciones responsables de enfermedades monogénicas humanas.