Estudio piloto de la ligadura quirúrgica del páncreas distal en modelo murino Kras de adenocarcinoma de páncreas

Abstract

Introducció i Justificació Clínica: L’adenocarcinoma de pàncrees (ADCP) té una elevada prevalença sent tractable de forma radical en <20% dels pacients, justificant la recerca en mètodes de diagnòstic i tractament precoç. Per a això, s’han desenvolupat en els darrers 15 anys models murins modificats genèticament que reprodueixen la seva oncogènesi. L&#8217;ADCP es desenvolupa a partir de lesions preneoplàsiques encara sense capacitat invasora. La lligadura del conducte pancreàtic principal (PDL) indueix una atròfia pancreàtica exocrina fisiològica a través de l’apoptosi; les cèl&#8226;lules acinars són substituïdes per teixit fibroadipòs, amb mediació del gen Tp53. Durant el desenvolupament de l’ADCP Tp53 s’inactiva, participant en el desenvolupament del càncer. Aquests efectes s’han descrit tant en l’àmbit clínic com en l’experimental. Però fins a la data no hi ha publicats estudis que descriguin com afecta la inducció de l’atròfia al desenvolupament de les lesions preneoplàsiques en un model d’ADCP. La hipòtesi d’aquest treball és que la PDL precoç, quan encara estan actius Tp53 i l’apoptosi, en un model ben definit d’ADCP, pot induir una atròfia exocrina suficient per evitar la progressió de lesions preneoplàsiques cap al càncer. L’objectiu va ser valorar l’efecte d’aquesta PDL a través de l’anàlisi histològica de les lesions preneoplàsiques, i de l’anàlisi genòmic. En relació a la metodologia, l’absència d’estudis similars implico realitzar un estudi pilot. Es va dissenyar un estudi analític, experimental, prospectiu, unicèntric en model murí, amb una estimació mostral de 88 animals distribuïts en 5 grups experimentals. Es va utilitzar el model murí Ptf1a-Cre (+/ki); K-ras LSLG12Vgeo (+/ki), desenvolupat al CNIO de Madrid. Es van establir: 1. El grup PDL-Kras, al qual se li va practicar una PDL selectiva al lòbul esplènic de pàncrees; 2. El grup sham- Kras, control de la tècnica quirúrgica, al qual es va sotmetre a una cirurgia de dissecció de l’istme pancreàtic, però sense PDL; i 3. El grup control-Kras, al qual no se li va sotmetre a cap cirurgia, analitzant només el desenvolupament de lesions preneoplàsiques intrínsec al model. Es van considerar altres dos grups control dels fons genètics utilitzats per al desenvolupament del model transgènic; els grups PDL-Cre i PDL-G, sotmesos a PDL. Es van analitzar al; 1r, 3r i 6è mesos postoperatoris (seguiment màxim: 9 mesos de vida) la presència i nombre de lesions preneoplàsiques (PanIN 1, 2, 3 i lesions planes atípicas- AFL) en el pàncrees proximal a la lligadura (PP) i en el pàncrees distal (PD; lòbul esplènic), per a cada grup experimental, així com l’expressió gènica diferencial. També es va analitzar l’impacte clínic i histològic de la PDL. Per a això, es van realitzar anàlisis: clíniques, bioquímiques, histològics, i genòmics (utilitzant Limma i GSEA). L’anàlisi estadística es va realitzar mitjançant SPSS. Resultats: En el grup PDL-Kras es van observar significativament menys lesions PanIN 1, 2 i AFL en els PD, en comparació amb els PP. Els grups control-Kras i sham-Kras van tenir un augment de 7 i 9 vegades del risc de presentar PanIN 2, 3 i AFL en el seu PD, respecte al PD dels ratolins PDL-Kras. A nivell genòmic, es va observar una inhibició de la funció acinar en els PD del grup PDL-Kras, així com una sobreexpressió en els PP de gens relacionats amb la carcinogènesi de l’ADCP. Es conclou així que: 1. La tècnica de la PDL en el model murí de PDAC considerat és un procediment inductor d’una atròfia exocrina i d’una disminució en el nombre de lesions preneoplàsiques al PD lligat, en comparació amb el PP no lligat. A nivell genòmic, podría inhibir l’expressió de gens relacionats amb la carcinogènesi de l’ADCP.

Introducción y Justificación Clínica: El adenocarcinoma de páncreas (ADCP) tiene una elevada prevalencia siendo tratable de forma radical en <20% de los pacientes, justificando la investigación en métodos de diagnóstico y tratamiento precoz. Para ello, se han desarrollado en los últimos 15 años modelos murinos modificados genéticamente que reproducen su oncogénesis. El ADCP se desarrolla a partir de lesiones preneoplásicas aún sin capacidad invasora. La ligadura del conducto pancreático principal (PDL) induce una atrofia pancreática exocrina fisiológica a través de la apoptosis; las células acinares son sustituídas por tejido fibroadiposo, con mediación del gen Tp53. Durante el desarrollo del ADCP Tp53 se inactiva, participando en el desarrollo del cáncer. Estos efectos se han descrito tanto en el ámbito clínico como en el experimental. Pero hasta la fecha no hay publicados estudios que describan cómo afecta la inducción de la atrofia al desarrollo de las lesiones preneoplásicas en un modelo de ADCP. La hipótesis de este trabajo es que la PDL precoz, cuando aún están activos Tp53 y la apoptosis, en un modelo bien definido de ADCP, puede inducir una atrofia exocrina suficiente para evitar la progresión de lesiones preneoplásicas hacia el cáncer. El objetivo fue valorar el efecto de dicha PDL a través del análisis histológico de las lesiones preneoplásicas, y genómico. En relación a la metodología, la ausencia de estudios similares implicó realizar un estudio piloto. Se diseñó un estudio analítico experimental, prospectivo, unicéntrico, en modelo murino, con una estimación muestral de 88 animales distribuídos en 5 grupos experimentales. Se utilizó el modelo murino Ptf1a-Cre (+/ki); K-ras LSLG12Vgeo (+/ki), desarrollado en el CNIO de Madrid. Se establecieron: 1. El grupo PDL-Kras, al cual se le practicó una PDL selectiva en el lóbulo esplénico del páncreas; 2. El grupo sham- Kras, control de la técnica quirúrgica, al cual se le sometió a una cirugía de disección del istmo pancreático, pero sin PDL; y 3. El grupo control-Kras, al cual no se le sometió a ninguna cirugía, analizando sólo el desarrollo de lesiones preneoplásicas intrínseco al modelo. Se consideraron otros dos grupos control de los fondos genéticos utilizados para el desarrollo del modelo transgénico; los grupos PDL-Cre y PDL-G, sometidos a PDL. Se analizaron al; 1º, 3er y 6º meses postoperatorios (seguimiento máximo: 9 meses de vida) la presencia y número de lesiones preneoplásicas (PanIN 1, 2, 3 y lesiones planas atípicas- AFL-) en el páncreas proximal a la ligadura (PP) y en el páncreas distal (PD; lóbulo esplénico), para cada grupo experimental, así como la expresión génica diferencial. También se analizó el impacto clínico e histológico de la PDL. Para ello, se realizaron análisis: clínicos, bioquímicos, histológicos, y genómicos (utilizando Limma y GSEA). El análisis estadístico se realizó mediante SPSS. Resultados: En el grupo PDL-Kras se observaron significativamente menos lesiones PanIN 1, 2 y AFL en los PD en comparación con los PP. Los grupos control-Kras y sham-Kras tuvieron un aumento de 7 y 9 veces del riesgo de presentar PanIN 2, 3 y AFL en su PD, respecto al PD de los ratones PDL-Kras. A nivel genómico, se observó una inhibición de la función acinar en los PD del grupo PDL-Kras, así como una sobreexpresión en los PP de genes relacionados con la carcinogénesis del ADCP. Se concluye así que: 1. La técnica de la PDL en el modelo murino de PDAC considerado es un procedimiento inductor de una atrofia exocrina y de una disminución en el número de lesiones preneoplásicas en el PD ligado en comparación con el PP no ligado. A nivel genómico, podría inhibir la expresión de genes relacionados con la carcinogénesis del ADCP.

Introduction and Clinical Justification: Pancreatic ductal adenocarcinoma (ADCP) has a high prevalence, being radically treatable in <20% of patients, justifying research into early diagnosis and treatment methods. To help to this aim, genetically modified murine models which reproduce its oncogenesis have been developed in the last 15 years. ADCP develops from preneoplastic lesions that are not yet invasive. Main pancreatic duct ligation (PDL) induces physiological exocrine pancreatic atrophy through apoptosis; acinar cells are replaced by fibroadipose tissue, a process Tp53 gene-mediated. During the development of ADCP Tp53 is inactivated, collaborating in the development of cancer. These effects have been described in both clinical and experimental settings but, up to date, there are no published studies that describe how atrophy induction affects the development of preneoplastic lesions in a ADCP model. The hypothesis of this work is that early PDL, when Tp53 and apoptosis are still active, in a well-defined model of ADCP, can induce sufficient exocrine atrophy to prevent the progression of preneoplastic lesions into cancer. The main objective was to assess the effect of PDL through histological analysis of preneoplastic lesions, and genomic analysis. Regarding methodology, the absence of similar studies implied carrying out a pilot study. An analytical, experimental, prospective, single-center study was designed using a murine model, with a sample estimate of 88 animals distributed in 5 experimental groups. The murine model Ptf1a-Cre (+/ki); K-ras LSLG12Vgeo (+/ki) was used, which was developed at CNIO in Madrid. The following were established: 1. Group PDL-Kras group, which underwent selective PDL in the splenic lobe of the pancreas; 2. Group sham-Kras, as control of the surgical technique, which underwent surgical pancreatic isthmus dissection, but without PDL; and 3. Group control-Kras, which did not undergo any surgery, analyzing only preneoplastic lesions development intrinsic to the model. Two other control groups of the genetic backgrounds used for the development of the transgenic model were considered; Groups PDL-Cre and PDL-G, subjected to PDL. Analysis were performed at; 1st, 3rd and 6th postoperative months (maximum follow-up: 9 months of life), regarding the presence and number of preneoplastic lesions (PanIN 1, 2, 3 and atypical flat lesions- AFL-) in the pancreas proximal to the ligation (PP) and in the distal pancreas (PD; splenic lobe), for each experimental group, as well as differential gene expression. The clinical and histological impact of PDL was also analyzed. To perform all this, clinical, biochemical, histological, and genomic analyzes (using Limma and GSEA) were carried out. Statistical analysis was performed using SPSS. Results: In PDL-Kras group, significantly fewer PanIN 1, 2 and AFL lesions were observed in the PD compared to the PP. The control-Kras and sham-Kras groups had a 7 and 9-fold risk-increase of presenting PanIN 2, 3 and AFL in their PD, compared to the PD of PDL-Kras mice. At a genomic level, an inhibition of acinar function was observed in PD of the PDL-Kras group, as well as an overexpression in PP of ADCP carcinogenesis-related genes. It is thus concluded that: 1. The PDL technique in the murine PDAC model considered is a procedure that induces exocrine atrophy and a decrease in the number of preneoplastic lesions in ligated PD compared to PP. At a genomic level, it could inhibit the expression of ADCP carcinogenesis-related genes.