New end-points to assess nanomaterials exposure effects

Abstract

Els nanomaterials (NMs) són considerats contaminants emergents, ja que la seua detecció està creixent en les diferents matrius ambientals, provocant riscos potencials per a la salut humana i per als ecosistemes. En aquest sentit, el principal objectiu d’aquesta Tesi ha estat proporcionar noves aproximacions metodològiques per a l’avaluació del perill dels NMs mitjançant models in vitro i ex vivo avançats, així com nous biomarcadors. En el nostre primer estudi es va desenvolupar un model nou per comprendre el risc d’exposició dels éssers humans a les nanopartícules de poliestirè (NPPS), com a model de micro-nanoplástics (MNPL). Per aconseguir aquest objectiu, les mostres de sang procedents de 5 donants es van exposar ex vivo a diverses dosis de NPPS i es van avaluar diferents biomarcadors en diversos subconjunts de glòbuls blancs perifèrics. Els resultats van mostrar marcades diferències en la internalització de NPPS, amb una absorció molt limitada en els limfòcits i molt alta en els monòcits. A més, l’avaluació del dany genotòxic de l’ADN va revelar una sensibilitat cel·lular específica, sent les cèl·lules polimorfonuclears i monòcits aquelles cèl·lules amb els nivells més significatius de dany genotòxic. A més, l’exposició a NPPS va desencadenar canvis en el secretoma sanguini, amb un augment significatiu en l’expressió de citoquines relacionades amb la resposta inflamatòria i immunitària, l’estrès i la proliferació cel·lular. En el segon estudi es va utilitzar el model ex vivo abans esmentat per avaluar l’impacte al secretoma sanguini de tres nanomaterials diferents basats en grafè (NMBG). Amb aquest objectiu, es va analitzar un gran panell de citoquines i els resultats van mostrar importants canvis en la seva expressió, estant la majoria d’ells relacionats amb la resposta immunitària i inflamatòria. Al mateix temps, es va utilitzar l’assaig del soft-agar indirecte per analitzar les conseqüències funcionals d’aquests canvis de citoquines. Els resultats van mostrar que el secretoma alterat per NMBG pot inhibir la capacitat de creixement cel·lular independent d’ancoratge de les cèl·lules HeLa, utilitzades com a model de línia cel·lular. En el tercer estudi les propietats de transformació cel·lular del nanocerio es van confirmar mitjançant un model in vitro de dosis baixes a llarg termini. Es van analitzar les propietats relacionades amb les cèl·lules mare canceroses, el creixement independent d’ancoratge i les capacitats d’invasió, ja que es consideren característiques oncogèniques importants impulsades per l’exposició als NMs. Així mateix, es van confirmar les seves possibles interaccions amb el condensat de tabac, com a model de contaminant cancerigen ambiental, mostrant una interacció positiva en la inducció de la transformació cel·lular. A més, es va avaluar una bateria de microRNAs relacionats amb l’adquisició del fenotip tumoral, revelant que les nanopartícules de diòxid de ceri i la coexposició produïen una toxicitat potencial al transcriptoma. Finalment, en el nostre quart estudi es van avaluar les possibles conseqüències epigenètiques de l’exposició a llarg termini a nanopartícules de titani i nanotubs de carboni de múltiples capes, específicament els canvis en l’expressió de microRNAs. La bateria de microRNAs analitzada va revelar un gran impacte en el perfil d’expressió de les cèl·lules exposades als dos nanomaterials. A més, a partir de la nostra bateria inicial, es va seleccionar un petit conjunt de cinc microRNAs com a possibles biomarcadors d’efecte després de l’exposició als NMs. Aquest conjunt va ser provat en les línies cel·lulars BEAS-2B i MEF, prèviament exposades a llarg termini a diferents NMs, mostrant efectes positius en totes les mostres provades, confirmant la idoneïtat d’aquesta bateria.

Los nanomateriales (NMs) son considerados contaminantes emergentes cuya detección está creciendo en las diferentes matrices ambientales, provocando riesgos potenciales para la salud humana y para los ecosistemas. En este sentido, el principal objetivo de esta Tesis ha sido proporcionar nuevas aproximaciones metodológicas para la evaluación del peligro de los NMs a través de modelos in vitro y ex vivo avanzados, así como de nuevos biomarcadores. En nuestro primer estudio se desarrolló un modelo novedoso para comprender el riesgo de exposición de los seres humanos a las nanopartículas de poliestireno (NPPS), como modelo de micro-nanoplásticos (MNPL). Para ello, las muestras de sangre procedentes de 5 donantes se expusieron ex vivo a varias dosis de NPPS y se evaluaron diferentes biomarcadores en diversos subconjuntos de glóbulos blancos periféricos. Los resultados mostraron marcadas diferencias en la internalización de NPPS, con una absorción muy limitada en los linfocitos y muy alta en los monocitos. Además, la evaluación del daño genotóxico del ADN reveló una sensibilidad celular específica, siendo las células polimorfonucleares y monocitos aquellas células con los niveles más significativos de daño genotóxico. Además, la exposición a NPPS desencadenó cambios en el secretoma sanguíneo, con un aumento significativo en la expresión de citoquinas relacionadas con la respuesta inflamatoria e inmunitaria, el estrés y la proliferación celular. En el segundo estudio, se utilizó el modelo ex vivo antes mencionado para evaluar el impacto a nivel del secretoma sanguíneo de tres nanomateriales diferentes basados en grafeno (NMBG). Para ello, se analizó un gran panel de citoquinas y los resultados mostraron importantes cambios en su expresión, estando la mayoría de ellos relacionados con la respuesta inmunitaria e inflamatoria. Al mismo tiempo, se utilizó el ensayo de soft-agar indirecto para analizar las consecuencias funcionales de estos cambios de citoquinas. Los resultados mostraron que el secretoma alterado por NMBG puede inhibir la capacidad de crecimiento celular independiente del anclaje de las células HeLa, utilizadas como modelo de línea celular. En el tercer estudio, las propiedades de transformación celular del nanocerio se confirmaron mediante un modelo in vitro de dosis bajas a largo plazo. Se analizaron las propiedades relacionadas con las células madre cancerosas, el crecimiento independiente del anclaje y las capacidades de invasión, ya que se consideran características oncogénicas importantes impulsadas por la exposición a los NMs. Asimismo, se confirmaron sus posibles interacciones con el condensado de tabaco, como modelo de contaminante cancerígeno ambiental, mostrando una interacción positiva en la inducción de la transformación celular. Además, se evaluó una batería de microARNs relacionados con la adquisición del fenotipo tumoral, revelando que las nanopartículas de dióxido de cerio y la co-exposición producían una toxicidad potencial a nivel del transcriptoma. Finalmente, en nuestro cuarto estudio se evaluaron las posibles consecuencias epigenéticas de la exposición a largo plazo a nanopartículas de titanio y nanotubos de carbono de múltiples capas, específicamente los cambios en la expresión de microARNs. La batería de microARNs analizada reveló un gran impacto en el perfil de expresión de las células expuestas a ambos nanomateriales. Además, a partir de nuestra batería inicial, se seleccionó un pequeño conjunto de cinco microARNs como posibles biomarcadores de efecto después de la exposición a los NMs. Este conjunto fue probado en las líneas celulares BEAS-2B y MEF, previamente expuestas a largo plazo a diferentes NMs, mostrando efectos positivos en todas las muestras probadas, confirmando la idoneidad de esta batería.

Nanomaterials (NMs) are considered emerging pollutants that are increasingly detected in different environmental matrices, with potential risks for human health and the ecosystems. In this sense, the focus of this Thesis has been directed to provide new approach methodologies for hazard assessment of NMs via advanced in vitro and ex vivo models, as well as novel biomarkers. From our first study, a novel approach was developed to understand the risk of polystyrene nanoparticles (PSNPs) exposure for humans, as a model of micro-nanoplastics (MNPLs). Thus, ex vivo whole blood samples from 5 donors were exposed to several doses of PSNPLs and different end-points were evaluated in diverse subsets of white peripheral blood cells (WBCs). The results showed sharp differences in PSNPLs internalization with very limited uptake in lymphocytes and high uptake in monocytes. Moreover, the genotoxic DNA damage evaluation revealed a specific cellular sensitivity, being polymorphonuclear cells (PMNs), and monocytes those cells with the most significant levels of genotoxic damage. Additionally, PSNPLs exposure triggered changes in the whole blood secretome, with a significant increase in the expression of cytokines related to the inflammatory, immune, and stress response, as well as cell proliferation. In the second study, the before-mentioned whole blood ex vivo model was used to evaluate the impact of three different graphene-based nanomaterials (GBNMs) at the level of the blood secretome. For that purpose, a large panel of cytokines was analysed, and the results showed important cytokine expression changes, most of them related with the immune and inflammatory response. At the same time, the indirect soft-agar assay, was used to unravel the functional consequences of these cytokine changes. The results showed that the GBNMs-altered secretome can inhibit the anchorage-independent cell growth capacity of HeLa cells, used as a model cell-line. In the third study, the cell-transforming properties of nanoceria were confirmed through a long-term low-dose in vitro model. Stem-like properties, anchorage-independent growth, and invasion abilities were analysed as they are considered important oncogenic features driven by NMs exposure. Also, their potential interactions with cigarette smoke condensate (CSC), as a model of environmental carcinogenic pollutant were confirmed, showing a positive interaction in the induction of cell transformation. Besides, a battery of microRNAs related to the acquisition of the tumoral phenotype was assessed, revealing that cerium dioxide nanoparticles (CeO2NPs) and the co-exposure produced potential toxicity at the transcriptome level. Finally, our fourth study evaluated the potential epigenetic consequences of long-term exposure to titanium nanoparticles (TiO2NPs) and multi-walled carbon nanotubes (MWCNT), specifically the microRNAs expression changes. The analysed microRNA battery revealed a big impact on the expression profiling in cells exposed to both nanomaterials. Moreover, from our initial battery, a small set of five microRNAs were selected as potential biomarkers of effect after NMs’ exposures. This set was tested in BEAS-2B and MEF cells previously long-term exposed to different NMs, showing positive effects in all the tested samples, confirming the suitability of this battery.