Vitamin D and canine leishmaniasis

Abstract

Les leishmaniosis són un grup de malalties causades per protozous del gènere Leishmania que es transmeten per vectors. La leishmaniosi visceral (LV) humana pot ser mortal si no es tracta, resultant en 26 000-65 000 morts a l’any. Els cànids són el principal reservori i hostes de Leishmania infantum, l’agent causant de la LV zoonòtica a la conca mediterrània. Es desconeixen els mecanismes que regulen el resultat final de la infecció, però és sabut que el sistema immunitari juga un paper clau en el control de la malaltia. Diversos estudis han demostrat que la vitamina D té un rol important en la resposta immune, activant el sistema immunitari innat i modulant la resposta adaptativa. A més, s’ha descrit la relació entre la deficiència de vitamina D i el risc de patir diverses malalties. L’objectiu de la tesis va ser estudiar si la vitamina D té una contribució rellevant en la leishmaniosi canina (LCan). Per això, es va mesurar la concentració de vitamina D en mostres de sèrum d’una població de gossos sans i malalts residents en zona altament endèmica i se’n va estudiar la relació amb paràmetres parasitològics i immunològics. Els gossos malalts presentaven nivells de vitamina D significativament més baixos que els no infectats i que els infectats asimptomàtics. A més, la deficiència de vitamina D es correlacionava amb paràmetres relacionats amb la progressió de la LCan. També vam investigar si variacions genètiques en el locus del gen del receptor de la vitamina D s’associa amb la progressió de la LCan, però les freqüències al·lèliques dels polimorfismes (SNPs) trobats no van resultar ser estadísticament diferents entre grups. Llavors, vam analitzar la concentració de vitamina D en mostres de sèrum preses en diferents períodes de l’any en una cohort de gossos sans. Els resultats van mostrar que no hi ha variació estacional dels nivells de vitamina D en gossos. També es va analitzar retrospectivament la concentració de vitamina D en gossos amb leishmaniosi clínica i gossos no-infectats a l’inici de l’estudi, quan tots els animals eren negatius a Leishmania, i un any després. Mentre que els gossos sans no van mostrar canvis en els nivells de vitamina D durant l’estudi, els que van desenvolupar leishmaniosi van mostrar una reducció significativa al final de l’estudi. Per tant, la concentració de vitamina D no és un factor de risc per desenvolupar LCan, sinó que disminueix amb el curs de la malaltia. Un model in vitro va demostrar que afegir vitamina D activa (1,25(OH)2D3) comporta una reducció significativa de la càrrega de L. infantum en macròfags canins. Analitzant l’expressió de gens relacionats amb la via de la vitamina D en monòcits canins primaris vam demostrar que l’expressió de la β-defensina CBD103 augmenta significativament amb l’addició de 1,25(OH)2D3. Els resultats van corroborar que la vitamina D juga un paper en el control del paràsit. Per últim, es va estudiar la viabilitat de la vitamina D com a adjuvant per potenciar l’efecte d’una vacuna enfront la leishmaniosi. Es va administrar vitamina D conjuntament amb una vacuna d’ADN encapsulada en liposomes a ratolins BALB/c. Dues setmanes després de la vacunació els animals van ser infectats amb L. infantum. Es va mesurar la càrrega parasitària en òrgans diana i es va avaluar la resposta immune abans de la infecció i sis setmanes després. La vacuna no va reduir significativament la càrrega parasitària, però amb la co-administració de vitamina D es va apreciar una tendència a disminuir-la. L’estudi de la resposta immunològica va suggerir que l’augment de limfòcits T CD4+ i CD8+ podrien haver contribuït en la protecció parcial aconseguida per la vacuna amb la vitamina D com a potenciador.

Las leishmaniosis son un grupo de enfermedades causadas por protozoos del género Leishmania que se transmiten por vectores. La leishmaniosi visceral (LV) humana puede ser mortal si no se trata, resultando en 26 000-65 000 muertes por año. Los cánidos son el principal reservorio y huéspedes de Leishmania infantum, el agente causante de la LV zoonótica en la cuenca mediterránea. Se desconoce el mecanismo que regula el resultado final de la infección, pero se sabe que el sistema inmunitario juega un papel clave en el control de la enfermedad. Varios estudios han demostrado que la vitamina D tiene un rol importante en la respuesta inmune, activando el sistema inmunitario innato y modulando la respuesta adaptativa. Además, se ha descrito la relación entre la deficiencia de vitamina D y el riesgo de sufrir algunas enfermedades. El objetivo de la tesis fue estudiar si la vitamina D tiene una contribución relevante en la leishmaniosis canina (LCan).

Para ello se determinó la concentración de vitamina D en muestras de suero de una población de perros sanos y enfermos de leishmaniosis residentes en una zona altamente endémica y se estudió la relación de ésta con parámetros parasitológicos e inmunológicos. Los perros enfermos mostraron niveles de vitamina D significativamente más bajos que los no infectados y que los infectados asintomáticos. Además, la deficiencia de vitamina D se correlacionó con parámetros relacionados con la progresión de la enfermedad. También investigamos si las variaciones genéticas en el locus del gen del receptor de la vitamina D se asocia con la progresión de LCan, pero las frecuencias alélicas de los polimorfismos (SNPs) encontrados no resultaron ser estadísticamente diferentes entre grupos.

Posteriormente se analizó la concentración de vitamina D en muestras de suero tomadas en diferentes periodos del año en una cohorte de perros sanos. Los resultados mostraron que no hay una variación estacional de los niveles de vitamina D en perros. También se analizó retrospectivamente la concentración de vitamina D en perros con leishmaniosis clínica y perros no infectados al inicio del estudio, cuando todos los animales eran negativos a Leishmania, y un año después. Mientras que los perros sanos no mostraron cambios en los niveles de vitamina D durante el estudio, los que desarrollaron leishmaniosis mostraron una reducción significativa al final del estudio. Por lo tanto, la concentración de vitamina D no es un factor de riesgo para desarrollar LCan, sino que disminuye con el curso de la enfermedad. Un modelo in vitro demostró que añadir vitamina D activa (1,25(OH)2D3) conlleva una reducción significativa de la carga de L. infantum en macrófagos caninos. Analizando la expresión de genes relacionados con la vía de la vitamina D en monocitos caninos primarios demostramos que la expresión de la β-defensina CBD103 aumenta significativamente con la adición de 1,25(OH)2D3. Los resultados corroboraron que la vitamina D juega un papel en el control del parásito.

Por últimos, se estudió la viabilidad de la vitamina D como adyuvante para potenciar el efecto de una vacuna frente la leishmaniosis. Se administró vitamina D junto a una vacuna de ADN encapsulada en liposomas a ratones BALB/c. Dos semanas después de la vacunación los animales se infectaron con L. infantum. Se determinó la carga parasitaria en órganos diana y se evaluó la respuesta inmune antes de la infección y seis semanas después. La vacuna no redujo significativamente la carga parasitaria, pero con la coadministración de vitamina D se apreció una tendencia a reducirla. El estudio de la respuesta inmunológica sugirió que el aumento de linfocitos T CD4+ y CD8+ podrían haber contribuido a la protección parcial conseguida cuando se administró vitamina D como potenciador junto a la vacuna.

Leishmaniasis are a group of neglected vector-borne diseases caused by obligate intracellular protozoan parasites of the genus Leishmania. Human visceral leishmaniasis (VL) can be fatal if left untreated, resulting in 26 000-65 000 deaths per year. Canids are the main reservoir and hosts of L. infantum, the causative agent of zoonotic VL in the Mediterranean Basin. The mechanisms that regulate the outcome of the infection are undisclosed, although it is well known that immune system plays a key role in leishmaniasis disease control. Several studies have shown that vitamin D plays an important immunomodulatory role by activating innate immune system and modulating the adaptive immune response. Furthermore, the relationship between vitamin D deficiency and the risk of suffering from a plethora of health disorders has been described. The aim of the thesis was to study if vitamin D have a relevant contribution in canine leishmaniasis (CanL).

Because of that, we measured vitamin D concentration in serum samples from a cohort of healthy and ill dogs from a highly endemic area and we have also studied the relationship of vitamin D concentration with parasitological and immunological parameters. The sick dogs presented significantly lower vitamin D levels than their non-infected and the asymptomatic counterparts. In addition, vitamin D deficiency correlated with several parameters linked to leishmaniasis progression. We also aimed to investigate whether genetic variation within the vitamin D receptor gene locus is associated with the progression of CanL, but the allelic frequencies of the four single nucleotide polymorphisms (SNPs) found were not statistically different between groups.

Afterwards, we analysed retrospectively vitamin D concentration in serum samples from a cohort of healthy dogs collected in different periods of the year. The results showed that there is not a seasonal variation of vitamin D concentration in dogs. We also analysed retrospectively vitamin D concentration in serum samples from dogs with clinical leishmaniasis and non-infected healthy dogs, in which we measured vitamin D levels at the beginning of the study, when all dogs were negative for Leishmania, and 1 year later. Whereas non-infected dogs showed no changes in vitamin D levels along the study, those developing clinical leishmaniasis showed a significant vitamin D reduction at the end of the study. Therefore, vitamin D concentration is not a risk factor for developing canine leishmaniasis, but it diminishes with the onset of clinical disease. An in vitro model using a canine macrophage cell line proved that adding active vitamin D (1,25(OH)2D3) leads to a significant reduction in L. infantum load. Analyzing expression of genes related to vitamin D pathway on primary canine monocytes, we showed that defensin CBD103 expression was significantly enhanced after active vitamin D addition. The in vitro results corroborated that vitamin D plays a role in parasitic control.

Finally, we studied the suitability of vitamin D as an adjuvant to enhance the effect of a DNA vaccine against VL. BALB/c mice were treated with vitamin D concomitantly with a DNA vaccine encapsulated in liposomes. Two weeks after vaccination, the animals were infected with L. infantum parasites. Parasite load was measured in target tissues and immune response was evaluated before challenge and six weeks post-infection. Our DNA vaccine did not significantly reduce parasite load in liver nor spleen, but vitamin D coadministration showed a tendency to diminish parasite load in target organs. The study of cell response in splenocytes suggested that higher levels of CD4+ and CD8+ T cells may be responsible for the partial protection mediated by the DNA vaccine with vitamin D as enhancer.