Molecular, biological and clinical implications of hydroxyolite system in breast cancer

Abstract

El càncer de mama és el càncer més freqüent entre les dones amb dos milions de casos nous diagnosticats el 2018. La comprensió del seu origen i la seva progressió a través de nous enfocaments té un gran interès. En aquesta tesi, contribuïm amb una nova línia de recerca basada en la biomineralització natural dels àcids nucleics, que transfereix coneixements de la ciència dels materials a la investigació clínica. Ens centrem en el contingut molecular de les calcificacions que s’observen en el càncer de mama, el seu paper com a vectors de transfecció no virals naturals (NVT) i la relació esperada amb la multifocalitat del càncer de mama.

La viabilitat de la biomineralització dels àcids nucleics ha estat demostrada recentment pel nostre grup mitjançant mètodes experimentals i computacionals amb la intenció última d’explorar la relació entre les calcificacions que es troben en el teixit tumoral, el procés de biomineralització de l’ADN i la seva funció biològica. Ho demostrem a Revilla-López et al. (Langmuir. 2019; 35(36): 11912-11922 https://doi.org/10.1021/acs.langmuir.9b01566), mitjançant les simulacions de Dinàmica Molecular, on es reporta que l’adsorció d’àcids nucleics és viable tant en hidroxiapatita (HAp) com en oxalat de calci (CaOx). Tot i això, només la HAp pot encapsular aquests biopolímers. Aquesta estructura híbrida integrada per HAp i àcids nucleics, anomenada hidroxiolita (HOli), és idèntica a un NVT inorgànic que és capaç d’introduir els àcids nucleics transportats pel mineral a una cèl·lula diana. Demostrem que la biomineralització de l’ADN, independentment del seu grau de metilació, és afavorida en HAp en comparació amb CaOx. A més, estudiem la influència dels ions Mg2+ i revelem que faciliten l’encapsulació de l’ADN a l’HAp però l’inhibeix a CaOx.

En segon lloc, explorem l’existència d’hidroxiolites en teixits humans de càncer de mama extirpats mitjançant l’espectroscòpia Raman. Fent ús d’un nou algoritme avançat d’imatge Raman en combinació amb tècniques d’anàlisi multivariant avançada (Marro et al., Cancers. 2021; 13(11):2658 https://doi.org/10.3390/cancers13112658), confirmem que les microcalcificacions d’HAp contenen ADN adsorbit i encapsulat demostrant la hipòtesi que el teixit natural crea estructures híbrides equivalents a un NVT.

En tercer lloc, investigem si les calcificacions naturals (és a dir, el fosfat de calci amorf (ACP), HAp i CaOx) poden actuar com a NVT (Rodríguez-Rivero et al., 2021 – preparat per enviar). Concloem, utilitzant un model de transfecció conegut (cèl·lules humanes epitelials de pulmó A549), que tots els vectors són capaços de transfectar, però l’eficiència de transfecció de l’ACP, precursor de les calcificaciones d’HAp, és molt superior a l’HAp i el CaOx. Estudiem l’efecte de l’addició de Ca2+ i Mg2+, demostrant que el Ca2+ millora la transfecció de tots ells i fins i tot fa factible la transfecció d’ADN nu. D’altra banda, confirmem que aquest NVT poden migrar a una distància determinada (fins a 50 mm), abans de transfectar la cèl·lula destí, simulant l’escenari clínic de multifocalitat.

L’estudi de la biomineralització de l’ADN en el teixit tumoral, la migració de partícules de DNA-HAp que protegeixen l’ADN de la degradació enzimàtica i la capacitat de transfecció de NVT naturals obren noves vies en la investigació del càncer. Els resultats d’aquesta tesi contribueixen a la comprensió de l’escenari clínic relacionat amb la multifocalitat del càncer de mama.

El cáncer de mama es el cáncer más frecuente entre las mujeres, con dos millones de nuevos casos diagnosticados en 2018. La comprensión de su origen y progresión a través de nuevos enfoques es de gran interés. En esta tesis contribuimos con una nueva línea de investigación basada en la biomineralización natural de ácidos nucleicos, transfiriendo conocimientos de la ciencia de los materiales a la investigación clínica. Nos centramos en el contenido molecular de las calcificaciones del cáncer de mama, su papel como vectores naturales no virales de transfección (NVT) y su relación esperada con la multifocalidad del cáncer de mama.

Nuestro grupo ha demostrado recientemente la viabilidad de la biomineralización de ácidos nucleicos utilizando métodos experimentales y computacionales con la intención última de explorar la relación entre las calcificaciones encontradas en el tejido tumoral, el proceso de biomineralización del ADN y su función biológica. Demostramos en Revilla-López et al. (Langmuir. 2019; 35(36): 11912-11922 https://doi.org/10.1021/acs.langmuir.9b01566), mediante simulaciones de Dinámica Molecular, que la adsorción de ácidos nucleicos tanto en hidroxiapatita (HAp) como en oxalato de calcio (CaOx) es factible. Sin embargo, sólo la HAp puede encapsular esos biopolímeros. Esta estructura híbrida compuesta de HAp y ácidos nucleicos, que denominamos hidroxiolita (HOli), es idéntica a un NVT inorgánico que es capaz de introducir los ácidos nucleicos transportados por el mineral en una célula diana. Demostramos que la biomineralización del ADN, independientemente de su grado de metilación, se ve favorecida en HAp en comparación con CaOx. Además, estudiamos la influencia de los iones Mg2+ y desvelamos facilitan la encapsulación del ADN en HAp pero lo inhibe en CaOx.

En segundo lugar, exploramos la existencia de hidroxiolitas en tejido de cáncer de mama humano recién extirpado mediante espectroscopia Raman. A través de un nuevo algoritmo avanzado de imágenes Raman en combinación con un análisis multivariado avanzado (Marro et al., Cancers. 2021; 13(11):2658 https://doi.org/10.3390/cancers13112658) confirmamos que las microcalcificaciones de HAp contienen ADN adsorbido y encapsulado, lo que demuestra la hipótesis de que el tejido vivo es capaz de crear estructuras híbridas equivalentes a un NVT.

En tercer lugar, investigamos si las calcificaciones naturales (es decir, fosfato cálcico amorfo (ACP), HAp y CaOx) pueden actuar como NVT (Rodríguez-Rivero et al., 2021 – preparado para presentar). Concluimos, utilizando un modelo de transfección conocido (células humanas epiteliales de pulmón A549), que todos ellos son capaces de transfectar pero la eficiencia de transfección del ACP, precursor de HAp, es mucho mayor que el de la HAp y CaOx. Estudiamos el efecto de aportar Ca2+ y Mg2+, demostrando que los iones Ca2+ potencian la transfección de todos ellos e incluso hacen factible la transfección del ADN desnudo. Por otro lado, confirmamos que tales NVT pueden migrar hasta cierta distancia (hasta 50 mm), antes de transfectar la célula diana, simulando el escenario clínico de multifocalidad.

El estudio de la biomineralización del ADN en el tejido tumoral, la migración de partículas HAp-ADN que protegen al ADN de la degradación enzimática y la capacidad de transfección del NVT natural abren nuevas vías en la investigación del cáncer. Los hallazgos de esta tesis contribuyen a la comprensión del escenario clínico relacionado con la multifocalidad del cáncer de mama.

Breast cancer is the most frequent cancer among women with two million new cases diagnosed in 2018. The understanding of its origin and progression through new approaches is of outmost interest. In this thesis, we contribute with a new line of research based on natural biomineralization of nucleic acids, transferring knowledge from materials science to clinical research. We focus on the molecular content of breast cancer calcifications, their role as natural non-viral vectors of transfection (NVT) and their expected relationship with breast cancer multifocality.

The feasibility of the nucleic acid biomineralization has recently been demonstrated by our group using experimental and computational methods with the ultimate intention to explore the relationship among calcifications found in tumor tissue, the process of DNA biomineralization and its biological function. We demonstrate in Revilla-López et al. (Langmuir. 2019; 35(36): 11912-11922 https://doi.org/10.1021/acs.langmuir.9b01566), by means of Molecular Dynamics simulation, that adsorption of nucleic acids in both hydroxyapatite (HAp) and calcium oxalate (CaOx) is feasible. However, only HAp can encapsulate those biopolymers. Such a hybrid structure composed of HAp and nucleic acids, we termed as hydroxyolite (HOLi), is identical to an inorganic NVT which is able to introduce the nucleic acids carried by the mineral into a target cell. We prove that DNA biomineralization, independently of its degree of methylation, is favored on HAp compared to CaOx. Moreover, we study the influence of Mg2+ ions and we unveil that Mg2+ facilitates DNA encapsulation in HAp but disables it in CaOx.

Secondly, we explore the existence of hydroxyolites in human breast cancer tissue freshly excised by using Raman spectroscopy. Through new advanced Raman imaging algorithm in combination with advance multivariate analysis (Marro et al., Cancers. 2021; 13(11):2658 https://doi.org/10.3390/cancers13112658) we confirm that HAp microcalcifications contain DNA adsorbed and encapsulated demonstrating the hypothesis that living tissue creates hybrid structures equal to a NVT.

Thirdly, we investigate if natural calcifications (i.e. amorphous calcium phosphate (ACP), HAp and CaOx) can act as NVT (Rodríguez-Rivero et al., 2021 – ready for submission). We conclude, using a known transfection model (A549 human lung epithelial cells), that all of them are able to transfect but transfection efficiency of ACP, a precursor of HAp, is much higher than HAp and CaOx. We study the effect of supplying Ca2+ and Mg2+, demonstrating that Ca2+ enhances the transfection of all of them and even makes feasible the transfection of naked DNA. On the other hand, we confirm that such NVT can migrate to a certain distance (up to 50 mm) before transfecting, simulating the clinical scenario of multifocality.

The study of DNA biomineralization in tumor tissue, the migration of HAp-DNA particles that protect DNA from enzymatic degradation and the capacity of transfection of natural NVT open new avenues in cancer research. The findings of this thesis contribute to the understanding of the clinical scenario related to breast cancer multifocality.