Bioavailability and effects of microplastics and nanoplastics on in vitro gastrointestinal models. A focus on nanopolystyrene as representative nano-sized plastic material

Abstract

Els plàstic s’utilitzen en incomptables aplicacions en diferents àmbits, com ara la construcció, l’agricultura, o la medicina, degut a la facilitat amb que es poden modificar les seues propietats fisicoquímiques, i la seua producció ràpida i de baix cost. És per això que la generació de residus plàstics que acaba contaminant el medi ambient creix de manera exponencial. Diferents factors ambientals afavoreixen processos químics, físics i biològics que fan que aquests residus es degraden, generant els micro- i nanoplàstics (MNPLs). A més a més, la nanotecnologia genera una gran quantitat de partícules de plàstic de mides nano- i micromètriques que s’utilitzen en cosmètics o productes de neteja, i acaben contribuint a la contaminació ambiental per plàstics. Aquest repte mediambiental va lligat a la exposició humana. No obstant, les actuals limitacions metodològiques no permeten fer estimacions precises sobre els nivells d’exposició humana als MNPLs, i la manca de dades sobre els efectes d’aquests en models de mamífer fa difícil establir si els MNPLs suposen un risc per a la salut humana. Amb la finalitat de contribuir al coneixement sobre l’exposició humana als MNPLs i els seus possibles efectes tòxics i genotòxics, hem dut a terme una revisió bibliogràfica de les últimes publicacions sobre la distribució dels MNPLs en aliments i l’aire que respirem, i hem fet estudis en models in vitro per esclarir els efectes biològics de les nanopartícules de poliestirè (PSNPs).

La revisió bibliogràfica, a més d’assenyalar les limitacions i els aspectes menys estudiats que condicionen l’avaluació de riscos dels MNPLs, defineix la ingestió com la major via d’exposició humana als MNPLs. Per això, hem estudiat les interacciones de les PSNPs amb diferents models in vitro de l’intestí humà, així com la toxicitat i la genotoxicitat d’aquests nanoplàstics en els nostres models. El nostre primer estudi confirma la capacitat d’internalització de les PSNPs en les cèl·lules Caco-2. No obstant, malgrat que les PSNPs arriben als nuclis cel·lulars en només 24 h, no produeixen efectes genotòxics.

Degut a l’interès en els possibles efectes que els MNPLs poden produir un cop ingerits, hem analitzat la internalització de les PSNPs en models in vitro que imiten la barrera intestinal humana, que inclouen la representació de les cèl·lules caliciformes (Caco-2/HT29) i les cèl·lules M (Caco-2/HT29/Raji-B). Els resultats obtinguts assenyalen les PSNPs com agents poc tòxics degut a la poca capacitat que tenen d’induir ROS o altres efectes. A més, malgrat la facilitat amb la que les PSNPs internalitzen, arriben als nuclis i travessen les barreres, no es van trobar efectes genotòxics o dany oxidatiu a l’ADN de les cèl·lules que formen aquests models.

La potencial capacitat dels MNPLs per actuar com a vectors d’altres contaminants tòxics fa més greu l’escenari d’exposició. Per això, hem introduït el disseny de co-exposició amb l’objectiu de cobrir aquest aspecte. Els nostres resultats demostren la interacció física entre les PSNPs i les nanopartícules de plata (AgNPs), utilitzades com a model de contaminant ambiental estès de manera global. Amb aquest estudi, hem confirmat la interacció física entre metalls/MNPLs utilitzant metodologies clàssiques adaptades als reptes actuals. A més, hem observat l’increment de la internalització de les AgNPs quan aquestes es combinen amb les PSNPs, malgrat que aquesta co-exposició no va induir efectes tòxics. D’una altra banda, es va demostrar que els complexos AgNPs/PSNPs internalitzen en les cèl·lules Caco-2 i arriben als nuclis cel·lulars, causant un increment en la tendència al dany genotòxic conforme augmenta la concentració de AgNPs quan es combina amb dosis altes de PSNPs. El nitrat de plata es va utilitzar en paral·lel en aquest estudi com a agent alliberador de ions de plata.

Hoy en día los plásticos se usan en incontables aplicaciones en diferentes ámbitos, como la agricultura, la medicina, la construcción o la electrónica, debido a la facilidad con que se puede modificar sus propiedades fisicoquímicas, y su producción rápida y de bajo coste. Esto ha dinamitado la generación de residuos plásticos que acaba contaminando el medioambiente. Distintos factores ambientales favorecen procesos químicos, físicos y biológicos que hacen que la basura plástica se degrade, generando los micro- y nanoplásticos (MNPLs). Además de estos, la nanotecnología genera una gran cantidad de partículas de plástico en las escalas de tamaño micro- y nano, que se usan en cosméticos o productos de limpieza, y acaban contribuyendo a la contaminación ambiental por plásticos. Este reto medioambiental está acompañado por la exposición humana. Sin embargo, las actuales limitaciones metodológicas no permiten hacer estimaciones precisas sobre el nivel de exposición humana a los MNPLs, y la escasez de datos sobre los efectos de los MNPLs en modelos de mamífero hacen que sea difícil definir si los MNPLs suponen un riesgo para la salud humana. Con el fin de contribuir al conocimiento sobre la exposición human a los MNPLs y sus posibles efectos tóxicos y genotóxicos, hemos llevado a cabo una revisión de las últimas publicaciones acerca de la distribución de los MNPLs en los alimentos y el aire que respiramos, y hemos realizado estudios en modelos in vitro para esclarecer los efectos biológicos de las nanopartículas de poliestireno (PSNPs). La revisión bibliográfica, además de señalar las limitaciones y lagunas de conocimiento que condicionan la evaluación de riesgos de los MNPLs, reveló que la ingestión es la mayor vía de exposición humana a los MNPLs. Por eso, estudiamos las interacciones de las PSNPs con diferentes modelos in vitro del intestino humano, así como la toxicidad y la genotoxicidad de los nanoplásticos en estos modelos. Con el primer estudio, confirmamos la capacidad de internalización en células Caco-2 de las PSNPs. Sin embargo, a pesar de que las PSNPs alcanzan el núcleo de las células en tan sólo 24 h, no producen efectos genotóxicos.

Debido al creciente interés en los posibles efectos que pueden producir los MNPLs tras su ingestión, analizamos la internalización de las PSNPs en modelos in vitro que imitan la barrera intestinal humana, incluyendo la representación de las células caliciformes (Caco-2/HT29) y las células M (Caco-2/HT29/Raji-B). Nuestros resultados apuntan a las PSNPs como agentes poco tóxicos debido a su poca capacidad para inducir ROS o otros efectos. Además, a pesar de la facilidad con la que las PSNPs internalizaron, alcanzaron el núcleo e incluso atravesaron las barreras, no produjeron genotoxicidad o daño oxidativo en el ADN de las células que forman dichos modelos.

La potencial capacidad de los MNPLs para actuar como vectores de otros contaminantes tóxicos agrava el escenario de exposición. Por eso, hemos introducido un diseño de co-exposición con el objetivo de cubrir este aspecto. Nuestros resultados demostraron la interacción física entre las PSNPs y las nanopartículas de plata (AgNPs), usadas como modelo de contaminante ambiental extendido globalmente. Con este estudio, confirmamos la interacción física entre metales/MNPLs usando metodologías clásicas adaptadas a los retos actuales. Además, observamos un incremento en la internalización de las AgNPs cuando éstas fueron combinadas con PSNPs, aunque esta co-exposición no indujo efectos tóxicos. Por otro lado, demostramos que los complejos AgNPs/PSNPs internalizan en las células Caco-2 y alcanzan el núcleo celular, causando un aumento en la tendencia al daño genotóxico conforme aumenta la concentración de AgNPs cuando se combina con dosis altas de PSNPs. El nitrato de plata se introdujo paralelamente en este estudio como agente liberador de iones de plata.

Owing to the wide range of tuneable physicochemical properties, and the rapid and low-cost production, plastics present uncountable applications in industry such as product packaging, agriculture, medical applications, building or electronics, among others. This fact leads to the corresponding exponential increase in the generated plastic waste that ends up contaminating the environment. Different environmental conditions favour physical, chemical and biological processes that drive plastic waste to a continuous degradation, generating the so-called micro- and nanoplastics (MNPLs). In addition to those, rapid advances in nanotechnology have driven to the target industrial production of plastic particles in the micro- and nano-size ranges used in cosmetic or cleaning products that contribute to plastic environmental pollution.

The increasing presence of MNPLs in nature represents an environmental challenge but this is also accompanied by the human exposure. Nevertheless, the current methodological limitations do not allow for accurate estimations on the levels of human exposure, and the scarcity of data on the effects of MNPLs in mammalian models hampers the understanding of whether the presence of MNPLs in different environmental niches and organisms may pose a risk for humans. Aiming to contribute to expand the knowledge on human exposure and the potential toxic and genotoxic effects of MNPLs on human health, we have reviewed the last publications referring to the occurrence of MNPLs in food and airborne, and we have performed extended in vitro studies on the biological effects of polystyrene nanoparticles (PSNPs).

Our review of literature revealed ingestion as the major human exposure route to MNPLs and highlighted the knowledge gaps and limitations conditioning the MNPLs hazard assessment. Therefore, we moved forward to evaluate the interactions of PSNPs with different human gastrointestinal in vitro models, as well as toxicity and genotoxicity of the nanoplastics in those models. We confirmed the ability of PSNPs to internalise into human-derived undifferentiated Caco-2 cells. Importantly, Caco-2 cells showed signals of general stress induction after the exposure to PSNPs. However, although PSNPs reached the cell nuclei in only 24 h, cells did not show genotoxicity.

Because of the heightened interest in the effects of MNPLs after their ingestion, we further analysed, the internalisation ability of PSNPs in Caco-2 based in vitro 2D models of the gut barrier which include representation of goblet (Caco-2/HT29) and microfold-cells (Caco-2/HT29/Raji-B). Our findings describe PSNPs as weak toxicants due to their low ability to induce ROS or other toxic effects. Similar to that found in the undifferentiated Caco-2 model, PSNPs did not exert genotoxic or oxidative DNA damage despite having a great internalisation capacity which allowed reaching cell nuclei and translocation across the barriers.

Although literature regarding MNPLs health effects show controversy, the exposure scenario is aggravated if the MNPLs’ ability as carriers of other hazard contaminants is considered. Therefore, we attempted to cover this aspect by introducing the co-exposure design. Our results demonstrated the physical interaction between PSNPs and a widespread legacy pollutant, silver nanoparticles (AgNPs). Importantly, we proved the adaptability of classical methodological approaches to novel technical challenges as it is the visualisation of the metals/MNPLs interplay. In addition, we observed an enhancement of AgNPs internalisation by undifferentiated Caco-2 cells, after the co-exposure to AgNPs/PSNPs, but not a higher induction of toxic effects after the co-treatment. On the other hand, AgNPs/PSNPs complexes internalised and reached Caco-2 cell nuclei, causing an increasing tendency to genotoxic damage as the AgNPs concentration increases when combined with high doses of PSNPs. Silver nitrate (AgNO3) was included in this study as a surrogate of silver ion releasing agent to confirm that the effects induced by AgNPs were not caused by released ions.