Cell-adhesive nanopatterns for musculoskeletal tissue engineering

Abstract

Injuries and conditions of musculoskeletal tissues are among the main causes of disability worldwide and there is a wide need for improved regenerative therapies. In vitro platforms and biomaterials that aim to guide stem cell differentiation should be designed considering that cells interact with their surroundings through nanoscale receptors at the membrane, attaching to ligands in the extracellular matrix. In this thesis we employ uneven dendrimer-nanopatterned substrates to modulate local cell-surface adherence of cells undergoing differentiation towards cartilage, tendon and bone. We aim to elucidate nanoscale adherence cues driving stem cell behaviour during the formation of these musculoskeletal tissues, and the corresponding mechanisms of sensing and transduction. Single and collective cell migration are an essential part of biological processes such as tissue development, wound healing and disease. In the first stages of cartilage formation, mesenchymal stem cells gather into clusters that set the structural bases for subsequent steps in morphogenesis. This process of mesenchymal condensation is limited by the ability of cells to migrate across the extracellular environment and establish cell-cell contacts. We live-imaged the onset of chondrogenesis on nanopatterns of cell-adhesive matrix ligand and found that local ligand density modulates both single and collective stem cell migration through directionality and velocity, impacting the rate of cell-cell collisions. The progressive transition from single cells to multicellular condensates is also guided by cell-cell contacts mediated by N-cadherin and gap junctions. We pose that, once two cells collide on nanopatterned substrates, mesenchymal condensation is regulated by the balance between contact inhibition of locomotion (cells resuming single migration) and contact following of locomotion (cells establishing a new condensation unit). Gap junction intercellular communication (GJIC) provides a continuous and efficient flow of biological information during tissue formation and is essential to sustain homeostasis and function in living organisms. This mode of intercellular communication is particularly important in avascular tissues such as cartilage. We use nanopatterned substrates to study how local ligand density modulates the structure, mechanical stability and protein network architecture within multicellular mesenchymal condensates in early chondrogenesis. We show that nanopatterns of high ligand density facilitate condensate growth and generate condensates that are more stable in culture, as well as increasing cell compaction in them. We demonstrate that high local ligand density nanopatterns promote gap junction protein expression, improve the architecture of the

intercellular protein network, and promote GJIC in mesenchymal condensates. We then design a condensate transplantation assay and show that cell sensing of ligand density is a continuous process, with cells responding to changing substrate conditions even if they are not in direct contact with it. Finally, we confirm that substrate information is sensed by integrin adhesions and propagated into the forming tissue through cytoskeletal tensions. As an application of nanopatterned substrates in regenerative therapies of musculoskeletal tissues, we induce cell differentiation towards cartilage, tendon and bone to unveil the optimal local ligand density that promotes it. Nanopatterns of high local ligand density promote chondrogenic differentiation through nuclear translocation of a mechanosensitive transcriptional activator. The same nanopattern configuration also promotes osteogenesis, although in this case cells form smaller adhesions than on low- and medium-density substrates. Tenogenesis is seemingly not affected by substrate ligand density. Given that tension exerted from cell membrane receptors is transmitted by the cytoskeleton to the cell nucleus, we analyse nuclear morphology on each condition according to cell fate. We find that cell response to nanoscale ligand density depends on both size and distribution of integrin adhesions around the cell, in a different manner for each of the three analysed lineages, and that nuclear stretching modulates the observed effects on differentiation.

Les lesions i les condicions dels teixits musculoesquelètics es troben entre les principals causes de discapacitat a tot el món i hi ha una gran necessitat de millorar les teràpies regeneratives. Les plataformes in vitro que tenen com a objectiu guiar la diferenciació de cèl·lules mare s'han de dissenyar tenint en compte que les cèl·lules interaccionen amb el seu entorn mitjançant receptors a nanoescala de la membrana, unint-se als lligands extracel·lulars. En aquesta tesi, utilitzem substrats amb nanopatrons de dendrímers per modular l'adhesió local en cèl·lules que s'estan diferenciant cap a cartílag, tendó i os. Dilucidem les condicions d'adhesió a nanoescala que modulen el comportament de les cèl·lules mare durant la formació d'aquests teixits musculoesquelètics, i els mecanismes corresponents de detecció i transducció. La migració cel·lular és una part essencial de processos biològics com el desenvolupament dels teixits. En les primeres etapes de formació del cartílag, les cèl·lules mare mesenquimals migren per formar condensats pluricel·lulars. Vam fer filmacions de l'inici de la condrogènesi i vam trobar que la densitat de lligands afecta la migració de cèl·lules mare individuals i col·lectives, i la formació de condensats. La comunicació intercel·lular d'unió bretxa (GJIC) proporciona un flux continu i eficient d'informació biològica durant la formació de teixit. Mostrem que els nanopatrons d'alta densitat de lligands generen condensats mesenquimàtics que són més compactes i estables en cultiu. També promouen l'expressió de proteïnes d'unió bretxa, milloren l'arquitectura de la xarxa de proteïnes intercel·lulars i promouen GJIC en condensats. Confirmem que la informació del substrat és detectada per les adhesions d'integrines i es propaga al teixit en formació a través de tensions citoesquelètics. Finalment, induïm la diferenciació cel·lular cap a cartílag, tendó i os per revelar la densitat de lligand local òptima que l'afavoreix. L'alta densitat de lligands promou la condrogènesi i l'osteogènesi, però no la tenogènesi. Trobem que la resposta cel·lular a la densitat de lligands a nanoescala depèn tant de la mida com de la distribució de les adhesions d'integrines al voltant de la cèl·lula, d'una manera diferent per a cadascun dels tres llinatges analitzats, i que l'estirament nuclear modula la diferenciació.